慢性丙型肝炎患者PBMC TBK1s表达*

李维娜 韩梅芳 宁 琴

机体的天然免疫是病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP） 识别入侵的病原微生物（如病毒）并释放细胞因子（如Ⅰ型干扰素），从而诱导机体产生抗病毒免疫反应。肿瘤坏死因子受体相关因子相关 NF-κB激活子（TANK）结合激酶 1（TBK1）[1-3]是天然免疫中重要的激酶，从NF-κB活性调节机制中鉴定出来，在抗病毒dsRNA反应中于包含Toll/IL-1R同源结构域（TIR）接头诱导干扰素-（TRIF）和病毒诱导信号接头（VISA）的下游被激活。TBK1能在体外磷酸化干扰素调节因子（IRF）-3和IRF-7[4-6]，与后者形成同型二聚体或异性二聚体，移位至细胞核内诱导I型干扰素和干扰素诱导基因的表达。研究证实，TBK1是 Toll样受体 3（TLR3） 和 RIG-I样解螺旋酶（RLH）信号途径产生干扰素必不可少的因素[6-9]。尽管宿主抗病毒反应是激发固有免疫反应和增强适当抗病毒免疫所必需的，但其过度活化会对正常的细胞产生不利影响。TBK1s是TBK1的一种剪接体，与TBK1相比缺乏外显子3～6，不含激酶区域，但仍具有结合IRF-3的能力。当感染Sendai病毒时，人和小鼠细胞中TBK1s均有诱导表达，并发现其能干扰RIG-I和VISA之间的相互作用，而其过表达能抑制IRF3核移位，进而负性调节病毒激发的干扰素信号途径[10]。本实验研究了TBK1s在丙型肝炎患者PBMC中的表达情况。

资料与方法

一、一般资料 自2008年6月至2008年7月在我科门诊就诊的慢性丙型肝炎患者20例，其中未经干扰素/利巴韦林治疗患者11例，平均年龄42岁，患者血清抗丙型肝炎病毒抗体阳性，平均HCV RNA载量为5.31IU/ml，血清ALT值为58.5IU/L；经干扰素/利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者9例，平均年龄37岁，抗丙型肝炎病毒抗体阳性，HCV RNA阴性，血清ALT均在正常范围。另选择健康人9例，平均年龄25岁。

二、RNA提取与cDNA逆转录扩增 取肝素抗凝静脉血10ml，采用淋巴细胞分离液分离PBMC。加入Trizol 1ml重悬、裂解细胞，提取RNA，分光光度计定量，电泳。取 RNA1μg，加入 1μlOligo（dT），双蒸水补足12μl，70℃水浴 10min，冰上冷却，4μl逆转录缓冲液，1μl10mmol/L dNTPs，2μlRNA 酶抑制剂，上述反应体系 37℃水浴 5min，加入 1μl逆转录酶，42℃水浴60min，70℃10min灭活酶，-20保存。

三、Real-time PCR 检测 TBK1、TBK1s、IFN-β和GAPDH基因选自人类基因库NCBI，采用primer 5.0软件设计特异性引物，引物（武汉博亚生物科技有限公司合成）序列如下：Tbk1上游：5’-GTGGTGGGTGGAATGAATCAT-3’；下游：5’-ATCACGGTGCACTATACCATTCTC-3’；TBK1s：上游:5’-TTCGTGGAAGACATAAGGTATAAAATAATTA-3’；下游：5’-TGCACCAGAAGGCTTTCCTG-3’；IFN-β：上游：5’-AGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC-3’；下游：5’-TGAGGCAGTATTCAAGCCTCC-3’；GAPDH：上游：5’-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3’；下游：5’GGGTGTCGCTGTTGAAGTCA-3’。Real-time PCR 反应体系为20μl，反应顺序如下:95℃变性60s，而后以95℃5s、56℃ 10s，72℃ 23s，循环 40 次。最后 60℃延伸10min，再降温至40℃维持60s。

四、统计学方法 应用SPSS软件，进行t检验。

结果

一、RNA完整性分析 获得的RNA和mRNA质量较高，经凝胶电泳，总RNA的28S和18S条带清晰，其A260/A280值大于1.8。扩增每个cDNA样品中的GAPDH，经4%琼脂糖凝胶电泳后，成像系统下观察可见60bp的清晰条带，各组样本逆转录的cDNA符合要求。

二、实时定量PCR结果 在未经干扰素/利巴韦林治疗的慢性丙型肝炎患者PBMC中，TBK1s mRNA水平明显高于健康对照组（P＜0.05，图1）。经过干扰素/利巴韦林治疗的HCV RNA阴性患者PBMCTbk1s mRNA 水平明显下调（P＜0.05，图 2），而 HCV 阳性或阴性患者PBMC TBK1和IFN-β的表达无明显差异（图3）。

图1 慢性丙型肝炎患者和健康人PBMC TBK1s

图2 慢性丙型肝炎患者与健康对照PBMC TBK1

图3 慢性丙型肝炎患者与健康对照PBMC IFN-βm－

讨论

I型IFN能在多重水平对免疫反应产生负性调节。例如，RNA解旋酶蛋白LGP2能够被病毒诱导产生并发挥负性调节作用。RNF125是一种E3泛素连接酶，能通过调节RIG-I降解来负性调节RIG-I诱导的抗病毒信号[11]，而I型IFN的产生可以通过TBK1前mRNA选择性的剪接进行负性调节[10]。

选择性剪接也叫可变剪接，是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或是在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。事实上，选择性剪接作为一些基因的接头和转录因子参与抗病毒反应[12～16]。例如，曾有人报道IRF-5选择性剪接异构体被至少两个替换启动子分别调节，而IRF-3和IRF-3a转录本的剪接可能是通过一种组织特异性模式来调节[12，13]。

我们的实验发现Tbk1s在慢性丙型肝炎患者PBMC中的表达显著高于健康对照人群，而在经过干扰素/利巴韦林治疗血清HCVRNA转阴的患者PBMC中，其表达水平下调。Tbk1水平在HCV感染时并未发生变化，而TBK1s的变化诱导I型IFN的生成，提示TBK1s的表达与丙型肝炎病毒感染相关，并可能在HCV感染的调控机制中发挥重要作用，这对抗病毒治疗有潜在的临床意义。

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