自体外周血干细胞对肝硬化患者肝纤维化的改善作用

董 毅,朱太岗,张飞虎,葛 曦,汤继春,李月红,刘连成

肝硬化是临床常见病、多发病,该病进入失代偿期后逐渐发展,最终可能导致肝功能衰竭。虽然肝脏移植取得了一定的效果,可是供移植的肝脏来源有限,况且器官移植的费用之高也令患者望而却步。目前临床上主要仍以保肝对症及预防并发症为主,终末期肝病的治疗总体效果不甚理想,因此尚需探讨新的治疗方法[1]。近年来骨髓干细胞移植治疗已在医学领域取得了令人瞩目的成就,也为终末期肝病的治疗提供了新方法,自体干细胞移植不存在免疫排斥及伦理问题,是一种具有广阔应用前景的有效治疗手段。现将我院开展的自体外周血干细胞治疗对肝硬化患者的肝纤维化改善情况作一分析报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择 2009年 9月～2010年 10月我院接受自体干细胞治疗的肝硬化住院患者 35例,男 25例,女 10例,年龄 24～63岁,中位年龄 51岁。其中肝炎后肝硬化 30例,酒精性肝硬化4例,血吸虫性肝硬化1例,肝功能Child-Pugh A级5例,B级 20例,C级 10例,患者治疗前均明确诊断肝硬化[2]。设常规治疗的肝硬化患者 20例为(B组)对照组。2组病例在性别、年龄分布、治疗前各项检测指标经检验差异无统计学意义,均有可比性。所有接受干细胞治疗患者均签署知情同意书。

1.2 手术方法 2组患者入院后均行内科对症治疗。A组在此基础上给予粒细胞集落刺激因子 400μg,皮下注射,连续 4 d,第 5天行外周血干细胞采集,单个核细胞计数 1.2×108/ ml～3.1×1010/m l,在DSA下经股动脉穿刺插管,置管于肝固有动脉进行造影,观察肝内血管情况及有无占位性病变,将干细胞细胞悬液经肝固有动脉缓慢注入,术毕拔管,穿刺点加压包扎后返回病房,穿刺侧下肢制动 8 h,常规使用抗感染及对症治疗3 d。

1.3 观察指标 分别于治疗后第 8周、24周观察患者肝纤维化指标[透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)]及肝脏影像学检查。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件分析结果,数据以¯x± s表示,组间比较定量资料根据方差齐性采用t或t′检验,治疗前后比较采用配对t检验,分类资料采用χ2检验,P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 2组治疗前后肝纤维化指标变化情况 见表 1～表 3。

2.2 肝脏B超检查 治疗前肝脏缩小,肝表现凹凸不平,呈结节状,弥漫性回声增强,分布不均匀。肝内血管粗细不均匀,血管扭曲、闭塞而看不到,尤以肝静脉明显,其主干变细,分支狭窄。门静脉由于血流受阻主干、右支及左支矢状部增粗,门静脉主干内径＞10mm,脾静脉内径大于 8mm。治疗后24周可见肝脏增大,实质回声致密,回声增强增粗。

3 讨论

肝纤维化发生发展的核心环节是肝星状细胞的活化,活化的肝星状细胞分泌组织金属蛋白酶抑制剂增加,导致细胞外基质降解减少,使细胞外基质在肝内沉积。肝纤维化及肝硬化是多种慢性肝病的终末期病理表现,目前传统的治疗手段难以从根本上修复肝脏的不可逆变化,肝移植是治疗各种终末期肝病的最有效方法。然而,由于供体来源不足、操作复杂、移植后免疫排斥和治疗费用昂贵等问题,限制了临床肝移植的发展。相比之下,细胞移植则具有来源广泛、创伤性小及可重复进行等优点,其中骨髓干细胞近年来被认为是最具治疗潜力的供体细胞。薛永杰等[3]对 152例经肝穿刺确诊为慢性乙型肝炎及肝硬化患者,应用放射免疫法检测血清透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原水平,结果发现肝脏病理炎症及纤维化分级与血清纤维化指标的水平有显著相关性,组间对比部分有统计学意义,炎症分级组较为明显。因此检测血清纤维化指标的水平对于判断肝脏炎症及纤维化程度有一定价值和意义。

表1 2组治疗前肝纤维化指标变化情况(±s)

表1 2组治疗前肝纤维化指标变化情况(±s)

组别 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A组 708.2±124.7 181.8±72.6 203.4±71.3 150.2±68.4 B组 722.1±114.2 193.3±98.4 224.9±104.8 148.8±78.3

表2 2组治疗8周肝纤维化指标变化情况(±s)

表2 2组治疗8周肝纤维化指标变化情况(±s)

组别 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A组 512.5±115.7 143.8±86.5 176.4±98.4 112.1±62.6 B组 711±125.7 184.2±84.7 211.4±114.7 141.3±74.7

表3 2组治疗24周肝纤维化指标变化情况(±s)

表3 2组治疗24周肝纤维化指标变化情况(±s)

注：治疗前A组与B组比较,P＞0.05;A组治疗前与治疗后 8周比较,P＜0.05,与治疗后24周比较,P＜0.01,A组治疗后8周与治疗后24周比较,P＜0.01;B组治疗前后比较,P＞0.05。

组别 HA(μg/m l) LN(μg/L) PCⅢ(μg/L)Ⅳ-C(ng/m l) A组 245.2±84.7 103.9±74.2 118.0±75.3 74.1±35.3 B组 708.3±123.5 195.5±90.7 222.7±95.4 158.3±66.2

干细胞是具有自我更新、高度增值和多向分化潜能的细胞群体,主要包括造血干细胞和间充质干细胞[4-5]。虽然数量非常少,但却有强大的自我更新能力,并可以定向或横向分化为多种组织细胞或组织前体细胞,如造血细胞、肝细胞、神经干细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、胰腺内分泌细胞、皮肤干细胞、Ⅱ型肺泡细胞、肾小管上皮细胞等。也正是因为干细胞具备了该种特性才使其向肝细胞分化成为可能。干细胞治疗肝病的巨大应用潜力有 3种细胞可能参与成体肝脏细胞的更新与修复,前 2种为处于分化终点的成熟肝细胞和肝前体细胞,但研究表明移植这两种细胞存在来源缺乏、治疗效果欠佳、免疫排斥等问题,这就需要第三类细胞,即来源于骨髓的多能干细胞。它的特点有：向肝细胞分化的多能性和专能性,强大的增殖能力,取材容易、损伤小、易于自体移植、无移植排斥反应,临床应用前景非常突出。

肝硬化的预后取决于患者的营养状况、有无腹水、血清胆红素和白蛋白水平以及凝血酶原时间,还与病因、年龄和性别有关。一般说来,病毒性肝炎引起的肝硬化预后较差,年龄大者,男性预后较差,如再出现肝肾综合征、肝性脑病、并发食管静脉大出血、严重感染等则病情危重,预后极差。内科保守治疗主要有：调整饮食与营养,还应补充足够的微量元素,保护肝功能,促进肝细胞修复,补充蛋白质,体育锻炼,禁戒烟、酒,慎用各类保肝药,严禁使用能够损害肝脏的药物,但总体疗效欠佳[6-7]。肝硬化往往因并发症而死亡,如何改善患者的预后,提高生存率,尚需探讨新的治疗措施。

近年来,关于干细胞在肝纤维化治疗中的研究越来越多。相关资料显示,干细胞除了有可以分化为肝细胞的潜能外,还可以通过表达高水平的MMPs,尤其是MMP-9来减少肝脏细胞外基质的沉积[8]。外周血干细胞进入肝内分化为肝细胞肝细胞板的修复可以减少肝内炎症反应,肝内的炎症因子减少,对肝星形细胞的激活减弱,对肝内纤维组织形成具有抑制作用。外周血干细胞可能通过细胞间信号传导来促进肝星形细胞凋亡及促进肝内纤维组织降解酶类的产生,使肝内纤维组织形成和降解的平衡趋于纤维组织降解的方向,促进肝纤维化的恢复。

骨髓干细胞在临床应用领域广泛,已取得一定疗效[9-10]。近年来国内外关于干细胞治疗肝病的应用越来越多,Kumar等[11]报告了原发淀粉样变性合并进行性肝衰竭,成功进行干细胞移植,术后随访 28个月,未出现疾病复发的临床征象。姚鹏等[12]行肝动脉介入分别将分离的自体骨髓干细胞移植入肝衰竭患者的肝脏,结果患者症状明显改善,转氨酶、胆红素和血氨水平明显下降,而白蛋白和凝血酶原活动度逐渐上升,未见严重并发症。许多报道得出类似的结果[13]。可见经肝动脉途径移植自体干细胞治疗晚期肝病疗效确切且副作用小,安全,能够促进患者肝功能改善。

我院采用外周血干细胞治疗肝硬化,在全密闭环境下采集,用一次性耗材,与骨髓采集相比减少污染的机会,且无痛,干细胞数量能达到治疗的要求,单个核细胞计数 1.2×108/ml～3.1×1010/ml。在DSA下经股动脉穿刺插管,尽量置管于肝固有动脉,观察肝内血管情况及有无占位性病变,将干细胞细胞悬液缓慢注入。治疗后患者的自觉症状改善较明显,观察全部 35例患者,第 8周肝纤维化指标较治疗前好转,但改善不明显,第24周肝纤维化指标明显改善。肝脏B超检查发现治疗后 24周可见肝脏增大,实质回声致密,回声增强增粗。未发生严重并发症,近期无不良反应出现。且发现干细胞治疗对肝纤维化的改善方面Child-Pugh B级患者改善明显,A级稍差,C级较差。由此可见该疗法优先用于 B级患者。外周血干细胞治疗肝病的优点：避免肝脏移植和肝细胞移植的排斥反应。避免长期服用免疫抑制剂带来的负反应,早期利用骨髓修复肝损伤、改善遗传性缺陷组织的功能以及代替退行性组织,可极大地延长生存期,回避了对胚胎干细胞应用的伦理争议,细胞来源获取方便且治疗费用低廉。可见骨髓干细胞移植治疗肝衰竭,可在一定程度上恢复肝功能,缩短治疗时间,改善预后。探索与验证干细胞移植治疗晚期肝病的新方法和新思路,为解决干细胞移植时细胞来源、患者的选择及合理移植途径等关键问题是有必要的。

目前,肝纤维化治疗仍是一大难题,骨髓干细胞移植为众多肝纤维化甚至肝硬化患者带来了曙光,被认为是最具应用前景的措施之一,但其作用机制尚不完全清楚,需要深入研究和探讨。尽管在实验研究中取得了可喜成果,但关于干细胞的临床研究还相对比较缺乏,因此,还需要更全面更完善的临床研究设计方案的出现。

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