无机解磷细菌的筛选、鉴定及其溶磷能力研究

陶 涛， 叶 明， 刘 冬， 杨 柳

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009)

自然界中大部分磷呈有机或无机磷化物状态存在，而且施入的水溶性磷肥很快转化为无效状态，不能被作物直接利用[1]，在我国，耕作土壤缺磷面积约占总耕地面积的2/3[2]。磷细菌在土壤矿物质形式的磷素转化过程中发挥着重要作用，与磷的转化、贮存与供应直接相关，能够改善土壤环境，使土壤中有效磷含量提高[3，4]，因此，提高土壤中有效磷含量成为当前研究的热点。据报道，具有解磷作用的微生物包括解磷细菌、解磷真菌和解磷放线菌，其中解磷细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、欧文氏菌属(Erw inia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、肠细菌属(Enterbacter)、微球菌属(M icrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌属(Brad yrhizobium)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆菌属(C lromobacterium)、产碱菌属(A lcaligenes)、节细菌属(Arthrobacter)、硫杆菌属(Thiobacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)等[5-8]。本文研究了不同碳氮源、碳氮量、可溶性磷量及pH值对几株解磷微生物溶解磷酸钙能力的影响，为研发微生物肥料提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

土样采集于合肥市郊区水稻田。

培养基:牛肉膏蛋白胨培养基;无机磷基础培养基[9]。

1.2 优良解磷菌株的筛选与鉴定

取10-5、10-4、10-3稀释液0.1 m L涂布于PKO固体培养基平板上，每梯度涂 3个平板，30℃培养72 h。

随机挑取平板上主要形态有明显区别的代表性菌落，划线到牛肉膏蛋白胨平板上，再挑取单菌落，划线培养于牛肉膏蛋白胨斜面，在4℃保存，备用。

将具有解无机磷能力的菌株 Pp1、Pp2、Pp3、Pp4、Pp5、Pc1、Pc2、Pc3、Pc4、Pc5、Pc6、Pc8摇瓶培养，测其溶磷量。

根据菌株生理生化特征，参照文献[10]对分离所得菌株进行鉴定。

1.3 溶磷能力影响因素

(1)碳氮源种类。依据不同碳氮源的组合配制培养基，其中碳源分别为葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉(均为10 g/L)，氮源(含氮量相同)分别为硫酸铵(0.5 g/L)、硝酸铵(0.30 g/L)、硝酸钾(0.77 g/L)，无机磷基础培养基其它成分不变。

(2)碳源量。无机磷基础培养基的碳源加入量分别为2、6、10、14 g/L。

(3)氮源量。无机磷基础培养基的氮源为硝酸铵，加入量分别为0.1、0.3、0.5、0.7 g/L。

(4)可溶性磷量。在无机磷基础培养基中加入K2 HPO4◦3H 2O，加入可溶性磷量为0、1、5、10mg/L，以研究其对解磷的影响。

(5)pH值。调节无机磷基础培养基的pH值为4、5、6、7。

分析以上影响因素时的实验条件均为30℃下培养72 h(140 r/m in)。

1.4 摇瓶培养

向100 m L三角瓶中加入30 m L培养基，再接种1m L菌体悬浮液，菌数约为108cfu/m L，同时做空白对照实验(加入1m L无菌水)，在30℃下培养72 h(140 r/m in)。

1.5 数据处理

含磷量用钼锑抗比色法测定，溶磷量以扣除对照值表示(m g/L)，试验数据采用Excel和SAS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 优良解磷菌株的筛选

各菌株的溶磷量如图1所示，由图1可知，各菌株溶磷能力差异较大，如菌株Pc3的溶磷量高达174.08 m g/L，而菌株 Pc8的溶磷 量只有20.98mg/L，所以选取其中4株溶磷能力较强的菌株(Pc1、Pc3、Pp2、Pp3)研究。

图1 各菌株的溶磷量

2.2 菌株鉴定

依据菌株的革兰氏染色、芽孢染色、淀粉水解、明胶液化、柠檬酸盐、硝酸盐还原、三糖铁、MR、VP、接触酶、发酵型等生理生化实验结果及文献[10]对菌株进行鉴定的方法可知，Pc1、Pp2、Pp3属于芽孢杆菌属(Bacillus)，菌株Pc3属于土壤单胞菌属(Agromonas)。

2.3 碳氮源对微生物溶磷的影响

2.3.1 碳氮源种类

不同碳氮源组合对溶磷能力的影响如图2所示。图2中，1代表葡萄糖，2代表蔗糖，3代表玉米淀粉;a代表(NH 4)2 SO4，b代表NH4 NO3，c代表KNO3;培养条件为:温度30℃、摇床转速140 r/min、发酵时间72 h。图3～图6皆同。

由图2可知，菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3在不同碳氮源培养基上，表现出不同的溶磷能力，差异较大，如菌株Pc3在玉米淀粉、硝酸铵无机磷基础培养基培养时，其溶磷量为106.80 mg/L，表现出较强的溶磷能力;而在玉米淀粉、硝酸钾无机磷基础培养基培养时，其溶磷量为-0.85 mg/L，这可能是因为菌株Pc3在此条件下溶磷活力受到限制，导致菌株Pc3的增长繁殖除了要利用其自身溶解的有效磷，还需消耗磷酸钙水解产生的有效磷，使得有效磷的质量浓度低于对照值。

同时可以发现，在以不同碳氮源为培养基比较菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3溶磷能力，所得溶磷能力大小顺序并不一致。

图2 不同碳氮源组合对溶磷能力的影响

2.3.2 碳氮量

碳源量对菌株溶磷能力的影响如图3所示。由图3可知，Pc1的溶磷能力随着碳源量的增加而增强(先快后慢)，Pp3在碳源量为2 g/L时，其溶磷量只有5.88mg/L，但当碳源量达到6 g/L时，其溶磷量高达85.95m g/L，此后溶磷能力随着碳源量增加又显著降低，而Pc3、Pp2的溶磷能力则呈明显波动。

图3 碳源量对菌株溶磷能力的影响

菌株溶磷能力与碳源量相关系数及其矩阵见表1所列。

由表1可知，菌株Pc1的溶磷能力与碳源量的相关性关系显著，菌株Pc3、Pp2、Pp3的溶磷能力与碳源量的相关性关系不显著。

表1 菌株溶磷能力与碳源量相关系数及其矩阵

氮源量对菌株溶磷能力的影响如图4所示，由图4可知，菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3在氮源质量浓度为0.1 g/L时，溶磷量均很小，菌株Pp3溶磷量仅为7.23 mg/L，且菌株Pc1的溶磷量在氮源质量浓度为0.3 g/L，达到一个峰值后，又随着氮源量的增加而增加，菌株Pc3、Pp2、Pp3的溶磷量随着氮源量的增加均显著增加。

图4 氮源量对菌株溶磷能力的影响

菌株溶磷能力与氮源量相关系数及其矩阵见表2所列。由表2可知，菌株Pc3、Pp2、Pp3的溶磷能力与氮源量的相关性显著，菌株Pc1的溶磷能力与氮源量的相关性不显著。

表2 菌株溶磷能力与氮源量相关系数及其矩阵

2.4 可溶性磷

可溶性磷对菌株溶磷能力的影响如图5所示。由图5可知，菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3在不加入可溶性磷时，溶磷量均最高，菌株Pc1、Pp2、Pp3在加入1 g/L可溶性磷时，溶磷量急剧下降，随着可溶性磷量的增加而增加，菌株Pc3的溶磷量随着可溶性磷的变化，溶磷量波动不大。

图5 可溶性磷对菌株溶磷能力的影响

菌株溶磷能力与可溶性磷量相关系数及其矩阵见表3所列。由表3可知，菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3的溶磷能力与可溶性磷量的相关性均不显著。

表3 菌株溶磷能力与可溶性磷量相关系数及其矩阵

2.5 pH值

pH值对菌株溶磷能力的影响如图6所示。由图6可知，Pc1、Pc3、Pp3的溶磷量均随着pH值的下降而升高，Pp2则在pH值为5时，溶磷量达到最大。

图6 p H值对菌株溶磷能力的影响

菌株溶磷能力与pH值相关系数及其矩阵见表4所列。由表4可知，菌株Pc1、Pc3、Pp3的溶磷能力与pH值的相关性显著，菌株Pp2的溶磷能力与pH值相关性不显著。

3 结束语

本实验中，从水稻根际共分离获得13株具有解无机磷能力的菌株，选取其中4株溶磷能力较强的菌株作为研究对象，并依据文献[10]对供试菌株进行鉴定，结果表明，菌株Pc1、Pp2、Pp3属于芽孢杆菌属(Bacillus)，菌株Pc3属于土壤单胞菌属(Agromonas)，其溶磷量为 102.77～ 174.08 mg/L，是文献[11]筛选的几株解磷细菌溶磷量的3～4倍。

相关研究表明，不同菌株分解Ca3(PO4)2的能力有很大的差异[8]，此外，同一株磷细菌在利用不同的碳源时表现的溶磷能力并不一致[12，13]，这说明解磷细菌表现出的解磷能力与其所处环境有很大关系。

本研究发现同一菌株在不同碳氮源培养基上，表现出的溶磷能力差异较大，且菌株Pc3、Pp2、Pp3的溶磷能力与碳氮源量相关性均显著，而菌株Pc1的溶磷能力与碳氮源量的相关性均不显著。

磷是微生物生长繁殖的必需营养元素之一，不足或过多都将影响微生物的生长繁殖以及生理活性，但本研究表明，菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3菌株的溶磷能力与可溶性磷量的相关性均不显著。大量的研究[3，14-16]发现，pH值与解磷量呈极显著负相关，但也有报道[17，18]认为两者之间存在显著的相关性。

本试验中Pc1、Pc3、Pp3的溶磷能力与pH值的相关性显著，菌株Pp2的溶磷能力与pH值相关性不显著。菌株Pc1、Pc3、Pp2、Pp3均具有高效解磷能力，关于其促生作用效果在进一步研究中，从而为后期研发微生物肥料提供科学依据。

[1] M eh ta S，Nautiyal C S.An efficien tm ethod for qualitative screening of phosphate-solubilizing bacteria[J].Cu rrent M icrobiology，2001，43:51-56.

[2] 陈廷伟.解磷巨大芽孢杆菌分类名称、形态特征及解磷性能述评[J].土壤肥料，2005，(1):7-9.

[3] 朱培淼，杨兴明，徐阳春，等.高效解磷细菌的筛选及其对玉米苗期生长的促进作用[J].应用生态学报，2007，18(1): 107-112.

[4] Tilak K，Ranganayaki N，Pal K K，et al.Diversity of plant g row th and soilhealth supporting bacteria[J].Cu rrent Science，2005，89(1):136-150.

[5] 李阜棣，胡正嘉.微生物学[M].第5版.北京:中国农业出版社，2000:228.

[6] 赵小蓉，林启美.微生物解磷的研究进展[J].土壤肥料，2001，(3):7-11

[7] Son H J，Park G T，Cha M X，et al.Solubilization of insoluble inorganic phosphate by a novel salt and pH-tolerant Pantoea agglomerans R-42 isolated from soybean rhizosphere[J].Ioresource Technol，2006，97(2):204-210.

[8] M olla M A Z，Chow dhury A A.M icrobialm ineralization of organic phosphate in soil[J].Plan t and Soil，1984，78: 393-399.

[9] 田 宏，李凤霞，张德罡，等.草坪草溶磷菌筛选及溶磷能力的初步研究[J].草业科学，2005，22(10):92-96.

[10] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社，2001:43-191.

[11] 林启美，赵小蓉，孙焱鑫，等.四种不同生态系统的土壤解磷细菌数量及种群分布[J].土壤与环境，2000，9(1):对压电致动器/传感器，能够在几乎不改变主结构特征模态应变分布的情况下，通过选择适当的控制电压权值使结构各阶模态的振动得到理想的控制效果，同时也可以通过调整状态变量权值αi来加强对相应模态的控制。

4 结束语

本文由线弹性压电层合结构有限元动力方程，进一步推导了压电智能结构的主动控制方程。运用ANSYS参数化语言(APDL)建立了四边固支方形压电智能板结构的有限元模型，并进行模态分析，将系统耦合有限元动力方程转化到模态坐标下的状态空间方程。采用LQR全状态最优反馈控制，考虑离散分布式压电致动器/传感器对于主结构特征模态应变/曲率分布的影响，分析了离散分布压电致动器对系统各阶模态的控制效果，结果表明:离散的分布式压电致动器/传感器可有效控制板结构的多模态振动;离散分布式压电致动器/传感器对于主结构特征模态应变/曲率分布的影响较小，合理选择压电致动器/传感器的数量及分布与寻求最优控制率一样重要;压电致动器在对系统产生控制作用的同时，由于受其分布位置的影响可能会引起或加强系统其它模态的振动。将本文数值算例结果与现有文献结果进行对比发现，配置9对压电致动器/传感器可以使结构各阶模态的振动得到理想的控制效果。

[参 考 文 献]

[1] Yousefi-Koma A.Active vib ration control of smart structures using piezoelement[D].Otlaw a:Conletom University，1997.

[2] Zabihollah A，Sedagahti R，Ganesan R.Active vibration suppression of smart lam inated beam susing layerw ise theory and an op timal control strategy[J].Smart M ater Stru ct，2007，16:2190-2201.

[3] Bailey T，Hubbard JE.Distributed piezoelectric-polymer active vibration control of a cantilever beam[J].Jou rnal of Guidance Control，1985，8(5):605-611.

[4] Narayanan S，Balamurugan V.Finite element modelling of piezolam inated smart structures for active vibration con trol w ith distribu ted sensorsand actuators[J].Journalof Sound and V ibration，2003，262:529-562.

[5] Xu S X，Koko T S.Finite element analy sisand design of actively controlled piezoelectric smart structu res[J].Finite E lements in Analysis and Design，2004，40:241-262.

[6] Sohn JW，Kim H S，Choi S B.Active vib ration control of smart hull structures using piezoelectric actuators[J].Proc IMech E Part C:J M echanical Engineering Science，2006，220:1329-1337.

[7] 钱 锋，王建国.压电智能结构振动控制的数值模拟[J].合肥工业大学学报:自然科学版，2010，33(1):76-80.

[8] Lim Y H.Finite-elemen t sim ulation of closed loop vibration controlof a smart plate under transient loading[J].Smart M ater Stru ct，2003，12:272-286.

[9] Leissa A W.V ib ration of plates[M].Washington D C: NASA SP-160，1969.

[10] 欧进萍.结构振动主动控制:主动、半主动和智能控制[M].北京:科学出版社，2003:82.