天津市汉族胎儿 D21S1411和 D21S1413 STR基因座遗传多态性的研究

孙立娟 李晓洲 史云芳 李 岩 岳天孚 张 颖

天津医科大学总医院遗传室(300052)

短串联重复序列(STR)基因座因在人类基因组中具有分布广泛、多态信息含量较高等特点受到国内外学者的关注,目前被广泛应用于产前诊断、群体遗传学以及法医学等领域。STR基因座的群体遗传学数据具有地域及种族差异[1],而目前大多 STR基因座的相关数据来自高加索人,因此,有必要筛选出本地区杂合度较高的 STR基因座。据报道,21号染色体上唐氏综合征(DS)关键区域内或附近的D21S1411和 D21S1413 2个 STR基因座的期望杂合度较高。故本研究选取这 2个基因座,调查其在天津市汉族胎儿中的杂合度(Ho)。同时,计算这 2个STR基因座的多态信息含量(PIC)、个体识别率(DP)和非父排除率(PE)等群体遗传学数据,为基因诊断及产前基因诊断 DS提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

211例产前诊断样本,包括绒毛组织 49例,羊水细胞 162例,均采自至天津医科大学总医院产前诊断中心就诊的妊娠 7～24周妇女,所有样本经细胞遗传学方法证实为正常核型。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常规苯酚 -氯仿法提取绒毛组织和羊水细胞的基因组 DNA。1.2.2引物的选择与合成 D21S1411和 D21S1413 STR基因座的引物序列参照基因库(www.GDB.org),由上海生工合成。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR) PCR反应体积为 25μl,反应体系为：1×PCR缓冲液,2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1 U Taq酶、约 120ng DNA,D21S1411和 D21S1413基因座引物终浓度分别为 0.1μmol/L和 0.3μmol/L。反应条件为：94℃预变性 3min;94℃变性 15s,62℃退火延伸 1m in,共 35个循环;62℃延伸 45min,4℃保存。

1.2.4 PCR扩增产物的检测 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),300 V恒压 1.5h,硝酸银染色。采用核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分析产物,记录结果。

1.2.5 建立等位基因分型标准阶梯 挑选样本中D21S1411和 D21S1413 2个 STR基因座所有的纯合子,重新行 PAGE,经核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分别测定这 2个 STR基因座各等位基因的分子量,建立 STR基因座各自的等位基因分型标准阶梯。

1.3 统计学处理

对观察到的 D21S1411和 D21S1413基因座的基因型分布进行 χ2检验,验证是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。采用Powerstate V12软件对群体遗传学指标进行分析,获得相关数据。

2 结果

2.1 复合 PCR扩增产物 PAGE电泳检测结果

211例产前诊断样本均扩增成功,经 PAGE电泳检测均表现为 1条带或 2条带,经核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分析发现,所有杂合子样本 2条带对应峰的峰高之比均约为 1：1。见图 1～3。

图 3 样本 5分子量曲线图 D21S1413 STR基因座出现 1个峰,表现为纯合子,片段大小为 160 bp;D21S1411 STR基因座出现 2个峰,表现为杂合子,片段大小分别为 303 bp和 287 bp

2.2 D21S1411和 D21S1413基因座等位基因分型阶梯

经核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统分析,天津市 211例汉族胎儿中D21S1411基因座共发现9种等位基因,等位基因片段长度介于 287～319 bp之间,相邻等位基因间相差 4bp,按片段由小到大依次命名为 1～9。天津市 211例汉族胎儿中 D21S1413基因座共发现 7种等位基因,等位基因片段长度介于 160～188 bp之间,相邻等位基因间相差 4bp,按片段由小到大依次命名为 1～7。见图 4、图 5。

2.3 D21S1411和 D21S1413基因座的等位基因及基因型分布

在 211例汉族胎儿样本中,D21S1411基因座共发现 45种基因型;D21S1413基因座共发现 28种基因型。天津市汉族胎儿 D21S1411和 D21S1413基因座的基因型例数及等位基因频率见表 1和 2。经检验,2个 STR基因座的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡定律。

表 1 D21S1411各基因型分布及等位基因频率

表 2 D21S1413各基因型分布及等位基因频率

2.4 D21S1411和 D21S1413基因座的群体遗传学特征

天津市汉族胎儿 D21S1411和 D21S1413基因座的 Ho、PIC、DP、PE等群体遗传学指标分析结果见表3。

表3 D21S1411和D 21S1413基因座的群体遗传学特征

3 讨论

STR基因座在人类基因组中分布广泛,平均每隔6～10kb就有一个。STR基因座多由 2～6个碱基作为核心单位,核心单位重复次数多为 15～30次,核心单位重复次数的变化构成了 STR基因座的遗传多态性,这种重复次数的差异在基因传递过程中遵循孟德尔共显性遗传规律[2]。STR基因座片段长度较短,一般为 100～400bp,很容易通过 PCR扩增,电泳分型。STR分型具有很高的灵敏度和良好的重复性,分型结果稳定可靠。由于检测方法简便、快速、准确度高,STR基因座目前已发展为最主要的个体识别检测标记,并广泛应用于群体遗传学、产前诊断、人口统计学等多个领域。

DS是最常见的染色体三体综合征,在新生儿中的发病率为 1/600～1/800,主要表现为智力低下及特殊面容。产前诊断发现 DS并及时终止妊娠是降低此类患儿出生的有效手段。目前产前诊断的常用方法是细胞遗传学方法,即通过绒毛取样、羊膜腔穿刺或脐静脉穿刺获得胎儿细胞,然后进行染色体核型分析。该方法已成为产前诊断染色体异常的金标准。但该方法存在步骤繁琐,均需人工操作等不足,不适合大规模应用。1993年 Mansfield等[3]首次将 STR基因座引入产前诊断染色体数目异常的研究,通过荧光标记引物扩增 21、18号染色体上的 STR基因座,在 13例 DS和18三体综合征中成功诊断 9例。同一STR基因座在不同个体可能出现不同长度的等位基因,其可能性的概率与该 STR基因座的杂合度和多态信息含量密切相关[4]。正常个体 STR基因座扩增后可表现为 2种情况：一种为纯合子,表现为 1条带;一种为杂合子,表现为 2条带,定量之比约为 1：1。而三体样本经 STR基因座扩增后,可表现为以下 3种情况：① 3个等位基因各不相同,即杂合子时,表现为 3条带,定量之比约为 1：1：1;②3个等位基因中有 2个相同,即半杂合子时,表现为 2条带,定量之比约为 2：1;③3个等位基因均相同,即纯合子时,出现 1条带。本实验中,所有胎儿均为正常核型,电泳均出现 1条带或 2条带,核酸/蛋白凝胶图像管理分析系统分析扩增产物,发现所有杂合子 2条带对应峰的峰高之比均约为 1：1。

为避免因 STR基因座杂合度不高所造成的漏诊,应尽可能挑选杂合度较高的 STR基因座作为遗传标记,同时可以联合 2个甚至更多的基因座以提高诊断的准确率。由于 STR基因座核心序列的重复次数在不同地区及不同种族中会有所不同,甚至差异显著[1],因而在应用 STR-PCR进行 DS产前基因诊断之前必须筛选出本地区本民族杂合度高的 STR基因座作为 21号染色体的遗传标记。本实验对天津市211例汉族胎儿样本 D21S1411和 D21S1413基因座进行分析。D21S1411基因座发现 9种等位基因,45种基因型;D21S1413基因座发现 7种等位基因,28种基因型。2个基因座基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡定律,说明该样本可反应天津市汉族胎儿的遗传状况。据文献[5]报道,DP＞0.8,PE＞0.5为多态信息含量高的标准,D21S1411和 D21S1413基因座的DP分别为 0.967和 0.947,PE分别为 0.516和 0.739,2个基因座均符合上述标准,可见这 2个基因座在天津汉族胎儿中多态信息含量较高,可用于染色体数目异常的研究。

本实验选用非变性 PAGE和银染法对 PCR产物进行检测。PAGE是一种常用的 DNA检测方法,凝胶化学性质稳定,样品用量少,其灵敏度较高。PAGE集浓缩效应、分子筛效应和电荷效应为一体,所以电泳分辨率较高,尤其适用于对较小的 DNA片段的分析(5～500bp)。而采用银染法染色,可以提高聚丙烯酰胺凝胶 DNA染色的灵敏度。该方法成本低,使用的仪器设备简单,结果可以直接用肉眼观察,易于掌握,尤其适用于广大基层医院。但应用 PAGE电泳和银染法检测 STR基因座扩增产物时,常在目标片段条带附近发现一些染色较浅的影子带。这些非特异性条带在一定程度上影响了分析带型的准确性,甚至可能对等位基因的判读产生影响。如何消除这些影子带是学者们一直致力研究的问题,但迄今为止尚无统一的认识和令人满意的方法。关于影子带产生的机理,Murray等[6]在研究 CA二核苷酸重复序列的PCR扩增时认为,CA重复序列区中 2bp的随机缺失或增加所导致的影子带可能是 DNA链在复制过程中滑动所致,并曾设想一种高效的 DNA聚合酶可以减少影子带的产生。武辉等[7]在三核苷酸重复序列的PCR扩增中,用普通 Taq DNA聚合酶与具有 3′→5′外切活性的 pwo DNA聚合酶相混合,可以消除影子带,在一定程度上证实了 Murray等的观点。在本实验中体会到,对于非变性 PAGE而言,恒定的电压和电泳温度是关键,因为温度可直接影响 DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的分子构像,从而影响条带的检出。室温电泳适用于大多数情况,但由于电泳时,尤其是高电压下电泳时,凝胶温度会升高,有可能对 STR基因座扩增产物的正确检出造成不良影响。针对上述情况,通常可采取减少凝胶厚度、降低电压、空气冷却或循环水冷却等措施来避免影子带的产生。本实验采用了控制电泳温度,并选用 150V低电压等措施来减少影子带的出现。

随着 DS产前筛查的普及,因筛查结果为高风险而行产前诊断的妊娠妇女日益增多,传统的细胞遗传学方法已不能满足临床产前诊断的需要。STRPCR技术用于产前诊断染色体数目异常,能够与细胞遗传学方法互补,对于临床而言是一种较好的选择。

1 Andonova S,Vazharova R,Dim itrova V,et al.Introduction of the QF-PCR analysis for the purposesof prenatal diagnosis in Bulgaria-estimation of applicability of 6 STR markers on chromosomes 21 and 18[J].Prenat Diagn,2004,24(3)：202-208.

2 Edwards A,Civitello A,Hammond HA,et al.DNA typingand genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats[J].Am J Hum Genet,1991,49(4)：746.

3 Mansfield ES.Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms[J].Hum Mol Genet,1993,2(1)：43-50.

4 Cirigliano V,VoglinoG,Ordoñez E,etal.Rapid prenatal diagnosisof common chromosome aneuploidies by QF-PCR,results of 9 years of clinical experience[J].Prenat Diagn,2009,29(1)：40-49.

5 童大跃,孙宏钰,伍新尧,等.中国南方汉族人群 9个 STR基因座多态性分析[J].中山大学学报,2009,30(4)：400-403.

6 Murray V,Chutima M,England PR.The determ ination of the sequences present in the shadow bands of a dinucleiotide repeat PCR[J].Nuc leic Acids Res,1993,21(10)：2395-2398.

7 武辉,张思仲,肖翠英.三核苷酸重复序列PCR扩增中影子带动产生及其消除的方法[J].中华医学遗传学杂志,1998,15(1)：42-45.