巨噬细胞条件培养基对胰岛素调节骨骼肌细胞作用的影响*

刘 婕 李金茹 牛文彦

肥胖导致2型糖尿病，肥胖者脂肪组织增生先于血管生成，造成脂肪组织缺氧。缺氧的脂肪组织吸引巨噬细胞浸润，脂肪细胞及浸润的巨噬细胞又可释放炎症因子，造成脂肪组织自身的胰岛素抵抗以及其他组织的胰岛素抵抗[1]。骨骼肌是胰岛素作用的主要靶组织，摄取大部分餐后升高的血糖，此作用主要由细胞膜上的葡萄糖转运子4（GLUT4）完成[2]。胰岛素刺激GLUT4从胞浆转位到细胞膜上，转运葡萄糖进入细胞。本研究应用本课题组已建立的过表达myc的C2C12小鼠骨骼肌细胞株（C2C12GLUT 4myc）[3]，用常氧或缺氧培养的巨噬细胞条件培基（Conditioned medium,CM）孵育C2C12GLUT4myc细胞，检测并比较它们对胰岛素调节GLUT4myc转位作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Raw 264.7巨噬细胞株由加拿大多伦多病童医院研究所Amira Klip教授馈赠，C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞株由本实验室建立。Hanks液、DMEM（天润善达公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），马血清（美国Gibco公司），Blastici⁃din-HCL（德国Calbiochem公司），胰岛素（加拿大Eli Lilly公司），抗myc抗体（美国Sigma公司），偶联辣根过氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗体（美国Jackson Immuno Research公司），增强化学发光底物检测试剂盒（美国PerkinElmer公司），小鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（北京四正柏生物科技有限工司），Trizol、cDNA合成试剂盒、Premix Ex Taq酶、TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、荧光实时定量PCR试剂盒（Takara宝生物工程公司），引物合成（北京奥科生物技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃，5%CO2条件下培养C2C12GLUT4myc成肌细胞，将成肌细胞接种到24孔培养板中，待细胞密度达100%时，再用含5%马血清的DMEM高糖培养基将其诱导分化为多核肌管，每2 d换液，于第5天用于实验。

1.2.2 巨噬细胞条件培基提取 用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养Raw 264.7巨噬细胞，按1×106/mL密度接种细胞于培养皿。于接种第3天，待细胞密度达90%时，更换为用于培养C2C12肌管的培养基，将细胞分为常氧组和缺氧组，缺氧组置于37℃，1%O2，5%CO2，94%N2下孵育，4 h后分别提取常氧培养的巨噬细胞条件培养基（CM-Nor）和缺氧培养的巨噬细胞条件培养基（CM-Hypo），离心取上清后孵育骨骼肌细胞。

1.2.3 免疫印迹检测GLUT1的表达 常氧或缺氧培养巨噬细胞后，裂解细胞，测蛋白后取40 mg裂解液，37℃加热30 min，7.5%SDS-PAGE电泳，免疫印迹检测GLUT1，一抗用抗GLUT1的兔抗体，二抗用偶联HRP的山羊抗兔抗体，以Ac⁃tinin 1作为内参，增强化学发光底物试剂盒检测，曝光，应用NIH Image J软件分析定量。

1.2.4 实验分组 本研究分3组：对照组为常规培养基，常氧组为常氧培养提取的巨噬细胞条件培基，缺氧组为缺氧培养提取的巨噬细胞条件培基，分别用这3种培养基孵育C2C12GLUT4myc细胞16 h。每组再分为胰岛素处理组和未处理组，每组实验重复9次。

1.2.5 偶联抗体吸光度分析法测定细胞膜上GLUT4myc的含量 处理细胞后，分别加或不加100 nmol/L胰岛素孵育20 min，用PBS洗，3%多聚甲醛固定，0.1 mol/L的甘氨酸淬火，5%脱脂牛奶封闭，再用抗myc抗体孵育1 h，用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG孵育1 h，加入底物邻苯二胺溶液，反应约10 min后终止，取上清液加入96孔板，用酶标仪在492 nm波长下测定上清液吸光度值，结果表示为相对于对照组中未加胰岛素组的倍数。

1.2.6 Real-time PCR测定巨噬细胞TNF-α mRNA水平 提取总RNA，取2 μg合成cDNA第一链，取2 μg cDNA产物及相应上下游引物加入12.5 mL SYBR®Premix Ex TaqTM（2×）体系内扩增,条件为95℃30 s，95℃5 s，57℃10 s，72℃34 s，40个循环，β-actin为内参。TNF-α上游引物为5′-CGTCGTAG CAAACCACCAA-3′；下游引物为5′-GAGAACCTGGGAGTA GACAAGG-3′。β-actin上游引物为5′-GGCTGTATTCCCCTC CATCG-3′；下游引物为5′-CCAGTTGGTAACAATGCCAT GT-3′。每组实验重复4次。

1.2.7 ELISA法检测巨噬细胞条件培基中TNF-α含量 将标准品和待测样品各100 mL加入酶标板中，37℃孵育90 min，洗涤，加生物素化抗体，37℃孵育30 min，洗板，加入酶结合物，37℃孵育30 min，洗板，加入显色剂，反应约10 min后终止，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，绘制标准曲线并计算TNF-α的浓度。每组实验重复4次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。2组间比较采用独立样本的t检验；多组间比较采用One-way ANOVA方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧巨噬细胞GLUT1的表达 与常氧培养组相比，巨噬细胞缺氧培养后GLUT1蛋白表达升高为常氧组的（3.83±0.62）倍，表明缺氧培养成功，见图1。

图1 缺氧巨噬细胞GLUT1表达

2.2 巨噬细胞条件培基对胰岛素刺激的GLUT4myc转位的影响 常氧组和缺氧组胰岛素刺激的GLUT4myc转位增加的倍数均低于对照组（均P＜0.01），但常氧组和缺氧组间的差异无统计学意义，巨噬细胞条件培养基可直接造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗，缺氧组并不比常氧组加重胰岛素抵抗，见表1。

2.3 巨噬细胞TNF-α mRNA的表达 测得巨噬细胞TNF-α mRNA表达量为相对值，常氧培养的巨噬细胞TNF-α mRNA表达为1.00±0.00，而缺氧培养的巨噬细胞TNF-α mRNA表达为常氧培养组的（1.46± 0.20）倍，差异有统计学意义（t=4.654，P＜0.001）。2.4 巨噬细胞分泌的TNF-α水平 测得巨噬细胞TNF-α表达量为相对值，常氧培养的巨噬细胞TNF-α表达量为1.00±0.00，缺氧培养的巨噬细胞条件培基中TNF-α为常氧培养组的（1.78±0.24）倍，差异有统计学意义（t=6.501，P=0.043）。

表1 巨噬细胞条件培养基对C2C12GLUT4myc细胞GLUT4myc转位的影响 （±s）

表1 巨噬细胞条件培养基对C2C12GLUT4myc细胞GLUT4myc转位的影响 （±s）

＊P＜0.05

组别 n 胰岛素刺激GLUT4转位的倍数统计学处理组比 P对照组（1）常氧组（2）缺氧组（3）F 999 1.61±0.27 1.30±0.18 1.32±0.13 6.557＊（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）0.003 0.006 0.808

3 讨论

肥胖是2型糖尿病一个重要的危险因素，肥胖可造成脂肪组织缺氧，巨噬细胞浸润，使脂肪组织处于慢性炎症状态，并使其分泌大量的炎性因子，导致脂肪组织胰岛素抵抗[4]。进入血液的炎性因子可影响胰岛素对其他组织的作用，脂肪组织分泌的炎性因子主要由浸润的巨噬细胞产生[5]。体外缺氧培养正常C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子的基因表达显著上调[1]。

笔者用1%O2孵育巨噬细胞，通过检测缺氧应答基因GLUT1表达的上调确定缺氧培养成功。通过检测C2C12GLUT4myc细胞膜上GLUT4myc数量变化（转位）可分析细胞摄取葡萄糖的变化[3]。本研究发现CM-Nor和CM-Hypo均增加基础状态下（未加胰岛素）GLUT4myc的转位，而不影响胰岛素作用下的GLUT4myc转位，导致胰岛素刺激的GLUT4myc转位增加的倍数低于对照组，表明CM直接造成骨骼肌胰岛素抵抗，推测CM中的炎性因子削弱了胰岛素作用。

TNF-α是巨噬细胞分泌的重要炎性因子，用TNF-α体外直接孵育骨骼肌细胞可以导致胰岛素抵抗[6]。本研究进一步测定常氧和缺氧培养后巨噬细胞的TNF-α mRNA和蛋白表达水平，发现缺氧培养的巨噬细胞TNF-α mRNA和蛋白表达均高于常氧培养组，但未发现两者造成的骨骼肌胰岛素抵抗程度存在差异。其原因可能是由于脂肪组织脂解增强，分泌游离脂肪酸增多。巨噬细胞分泌的炎性因子如TNF-α可能通过促进脂解作用，在全身胰岛素抵抗中发挥作用[7]。缺氧的脂肪组织招募巨噬细胞浸润，并促进巨噬细胞分泌大量的炎性因子。单独缺氧培养巨噬细胞尽管能上调TNF-α的表达，但升高的TNF-α不足以造成更严重的胰岛素抵抗。本课题组待发表的研究发现缺氧培养的脂肪细胞条件培养基比常氧的脂肪细胞条件培养基造成更严重的骨骼肌胰岛素抵抗，并吸引更多的巨噬细胞浸润。后续的研究应将脂肪细胞和巨噬细胞共同缺氧培养，检测两者相互作用是否能分泌更多的炎性因子或脂肪酸，从而比单独缺氧培养一种细胞造成更严重的骨骼肌胰岛素抵抗。

综上所述，巨噬细胞的CM-Nor和CM-Hypo造成C2C12GLUT4myc骨骼肌细胞GLUT4myc转位的胰岛素抵抗，表明炎性因子削弱胰岛素作用，但缺氧上调的TNF-α不足以造成更严重的胰岛素抵抗。

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