宠物源铜绿假单胞菌耐药性调查

杨 铜,邓玉婷,田 伟,周颖泽,姚琼芬,叶燕珊,陈 丽,刘健华

(华南农业大学兽医学院国家兽药残留基准实验室,广东广州 510642)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA),俗称绿脓杆菌,在自然界广泛分布,是动物和人常见的条件性致病菌,已成为医院获得性感染最重要的致病菌之一[1]。有研究表明,在美国医院获得性感染中,PA在所有的病原菌中排名第5位,在革兰阴性菌中排第二[2]。国内细菌耐药性监测结果显示,该菌是引起医院感染的第二位病原菌,其检出率高达16.4%,仅次于大肠埃希菌[3]。由于存在多种主动外排系统,铜绿假单胞菌对多种抗菌药物表现为天然性或获得性耐药,故在其所致感染时可供选择的有效抗菌药物甚少。同时,随着抗菌药物的广泛使用,其耐药率不断升高,给临床治疗和控制带来了很大的困难,成为临床抗感染治疗中的一个难点[4-5]。

铜绿假单胞菌是犬、猫脓皮症和尿道感染的常见病原菌,可引起犬的外耳炎和猫的角膜炎等。目前,国内外已有大量关于人源菌株耐药性的研究[1,5-6],动物源铜绿假单胞菌耐药情况仅在国外有少量的报道[1,7]。本试验拟调查宠物源铜绿假单胞菌对临床常用抗菌药物的敏感性,为宠物临床抗菌药的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2009年7月至2010年3月,从广州市3家和深圳市1家宠物医院采集健康或患病犬猫的直肠拭子、脓汁、鼻液、眼分泌物、耳分泌物等共472个样品。

1.2 药品及培养基 链霉素、氯霉素、萘啶酸和盐酸四环素购自广州威佳科技有限公司,氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、黏菌素、头孢曲松纳、头孢他啶、环丙沙星购自中国药品生物制品检定所,氟苯尼考和恩诺沙星购自中国兽医药品监察所。阿莫西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南及哌拉西林药敏纸片购自OXOID公司。LB肉汤、LB琼脂、MH琼脂、MH肉汤、十六烷三甲基溴化铵琼脂购自青岛海博生物技术有限公司。

1.3 细菌分离鉴定 将样品接种于LB肉汤试管中,37℃恒温摇床培养16～18 h。划线于十六烷三甲基溴化铵琼脂上,培养18～24 h后,挑取边缘粗糙不齐、灰色或使琼脂变成绿色的可疑菌落进行纯培养,对纯培养后的菌进一步采用PCR方法进行鉴定。参考Lavenir等[8]报道的gyrB引物序列,由北京华大生物工程有限公司合成。用水煮法提取细菌DNA,根据一般的PCR反应程序进行。阳性PCR产物送北京华大生物工程有限公司测序,将测序结果提呈NCBI进行序列比对。

1.4 药物敏感性检测 除阿莫西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南及哌拉西林采用纸片扩散法检测药物敏感性外,其余药物均采用琼脂稀释法,两种方法按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的操作程序进行,同时用大肠杆菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853作为质控菌株。参照CLSI的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)。

2 结果

2.1 细菌分离、鉴定结果 根据菌落形态和gyr B基因测序结果,从临床采集的472个样本中共分离鉴定铜绿假单胞菌49株,每只动物仅分离1株菌。

2.2 抗菌药物敏感性结果 铜绿假单胞菌对18种抗菌药物的敏感性结果如表1所示。49株菌对β内酰胺类抗生素中的氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸均100%耐药,头孢曲松、头孢他啶、哌拉西林和头孢哌酮/舒巴坦耐药率较低,分别为10.2%、10.2%、6.1%和2.0%,对碳青霉烯类抗生素敏感,仅有 1株菌对美罗培南表现出耐药。对萘啶酸100%耐药,对环丙沙星和恩诺沙星的耐药率分别为20.4%和18.4%。氨基糖苷类抗生素中耐药率最高的为链霉素(55.1%),其次为庆大霉素16.3%,阿米卡星6.1%。在其他几种抗菌药物中,氟苯尼考98.0%,其他依次为四环素 93.9%,氯霉素89.8%和黏菌素26.5%。除阿米卡星、庆大霉素和环丙沙星外,其余MIC90均大于或等于32μg/m L。

表1 49株宠物源铜绿假单胞菌药物敏感性结果

49株宠物源铜绿假单胞菌全部对至少4种抗菌药物耐药,其中只有1株菌只耐4种抗菌药物,其余48株菌均对4种以上抗菌药物耐药,1株菌同时耐14种药物。4～5耐菌株为6株(12.2%),6～7耐菌株有 25株(51.0%),8～9耐菌株有 8株(16.3%),9耐以上菌株为10株(20.4%)。其中7耐菌株最多为13株占26.5%。同时对哌拉西林、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素和亚胺培南5种治疗铜绿假单胞菌感染最主要药物中的3种或3种以上药物耐药的菌株称为多重耐药铜绿假单胞菌(multidrug-resistant PA,MDRPA)[5],在研究中共发现3株,占6.2%。

3 讨论

3.1 宠物源铜绿假单胞菌耐药现状 铜绿假单胞菌能够通过自身的外排泵系统和外膜蛋白在能量的支持下选择性或非选择性将药物排出而对多种药物产生天然耐药,包括青霉素类、氯霉素类、四环素类和喹诺酮类等药物,同时该菌还可通过获得性耐药机制对多种临床常用抗菌药物产生耐药,因此给临床治疗带来严重困难[9]。本研究结果显示,铜绿假单胞菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸和萘啶酸的耐药率均为100%,对氯霉素、氟苯尼考和四环素也有极高的耐药率,均达到了90%左右,而氟喹诺酮类、氨基糖苷类、第三代头孢菌素、哌拉西林和头孢哌酮/舒巴坦等耐药率均较低,该结果和预期基本一致。由此可见,这些药物在治疗临床铜绿假单胞菌感染还可能会有比较好的效果。对于出现1株耐美罗培南菌株应引起我们的重视,因为美罗培南被认为是人医临床治疗铜绿假单胞菌重度感染的最后几种药物之一[10],宠物出现耐碳青霉烯类药物的菌株必将带来严重的公共卫生问题。由于所调查宠物医院未用过碳青霉烯类药物,此美罗培南耐药菌株有可能是由人体通过某些途径传播给宠物。另外,本研究中发现有多重耐药铜绿假单胞菌,它们的出现会使得治疗铜绿假单胞菌感染用药选择越来越少。

3.2 与国内人源铜绿假单胞菌耐药性的比较 铜绿假单胞菌已成为了医院获得性感染的重要条件性致病菌之一,近年来关于人医临床铜绿假单胞菌的耐药性国内外均做了大量的研究和报道,其总体结果显示,铜绿假单胞菌的耐药率呈现上升趋势。中国2008年CHINET[3]和2006～2007年Mohnarin[11]细菌耐药监测结果表明,人源菌株对临床上使用的氟喹诺酮类药物耐药率为25.2%～39.7%,对阿米卡星的耐药率为15.5%～21.9%,对头孢他啶的耐药率为21.0%～29.9%,对哌拉西林的耐药率为32.6%～43.1%,对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为14.8%～21.3%,对碳青霉烯类药物的耐药率为24.5%～33.2%。广州医学院附属第一医院2007年的耐药监测结果显示,铜绿假单胞菌对以上药物的耐药率分别为35.4%、13.1%、33.1%、34.6%、23.5%、30.6%～36.5%[6]。与人源菌株耐药率相比,本试验的宠物源菌株的耐药率要低很多,究其原因可能是由于人源菌株多分离于住院病人,其中相当一部分是从重症监护病房分离所得菌株,在大剂量的抗生素使用压力下产生了较高的耐药性。

3.3 与国外宠物源铜绿假单胞菌耐药性比较 由于铜绿假单胞菌引起宠物的感染越来越多,加之其耐药机制复杂且极易对抗菌药物产生交叉耐药和多重耐药,给临床治疗带来较大困难,因此部分国外学者已对宠物源该菌的耐药性做了相关报道。Rubin等[1]的研究显示,宠物源铜绿假单胞菌对氨苄西林、氯霉素、四环素、奈啶酸以及阿莫西林/克拉维酸的耐药率均超过90%,敏感性较好的是庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南,耐药率均在10%以下,环丙沙星的耐药率为16%,与本试验结果基本一致。但恩诺沙星和头孢曲松的耐药率均在30%以上,明显高于本试验的18.4%和10.2%,究其原因可能是国内外宠物临床治疗药物的选择不同所造成的。另外,Rubin等[1]的研究同样发现碳青霉烯类药物耐药菌株。

本试验首次报道了国内部分地区宠物源铜绿假单胞菌的耐药状况,发现铜绿假单胞菌耐药状况比较严重,但对头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素和氟喹诺酮类抗菌药的敏感性较高。结果提示有必要开展宠物源细菌耐药性监测,对铜绿假单胞菌的耐药性进行更为深入的研究对制定特异性的治疗方案具有极其重要的作用。

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