中国汉族人群高血压脑出血患者NFATC1基因rs754093多态性观察

肖健齐,许 晶,李新颖,康铁江,邱丽莎,吴安华,王运杰＊

(1齐齐哈尔市第一医院,黑龙江齐齐哈尔 161005;2中国医科大学附属第一医院)

脑出血是由环境因素、多种致病高危因素和遗传因素共同作用导致的一类极其复杂的疾病,遗传因素在脑出血的发生、发展及病理生理方面更是起着十分重要的作用。研究表明,活化 T细胞核因子1(NFATC1)基因与高血压脑出血密切相关[1,2]。2008年 2月 ～2009年 6月,我们观察了转录因子NFATC1基因rs754093多态性与高血压脑出血的关系,从分子水平探讨脑出血的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 汉族高血压脑出血 230例(观察组),男 144例、女 86例,年龄33～85岁,均符合全国第四次脑血管疾病学术会议修订的高血压脑出血诊断标准,均经临床、CT和(或)MRI扫描确诊。入选者均为临床首次脑出血或曾有脑出血病史,但未遗留后遗症。排除其他各种原因引起的脑出血,排除自身免疫性疾病、严重肝肾疾病、妊娠者、甲状腺疾病、血液病者。对照组为同期体检的正常人群,性别、年龄、民族等与观察组相匹配,共 233例。其中男 146例、女 87例,年龄 34～81岁。均向所有入选对象说明情况并签署知情同意书。

1.2 NFATC1基因rs754093多态性检测 采用多聚酶链反应—限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测。两组均取静脉血各5 ml,采用EDTA抗凝后,提取DNA。利用引物设计软件Primer5.0,在含遗传标记的DNA序列上设计PCR引物,并将设计的多对引物在BLAST网络服务系统中进行引物的同源性比较。选出同源性最小而Tm值合适的引物确定为PCR反应引物,交由大连宝生物工程有限公司合成,反应在PCR仪上进行。正向引物为5′-AGGGGTTAAGTCCTCTCCCAAG-3′,反向引物: 5′-GGAGTCCGAGGTGACAGTGG-3′。PCR反应体系50μl,包括DNA模板50 ng,1.5mMMgCl2、0.2mM dNTPs、1.0μM引物和3 U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性 3min,94℃变性 60 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共 30个循环;最后 72℃保温7m in。AvaⅡ酶切PCR产物,20μl反应体系中,包括200 ng PCR产物、2.0μl 10倍缓冲液、10 U AvaⅡ内切酶,反应条件为 37℃温浴过夜。产物的鉴定:8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,用凝胶显像仪摄片。PCR产物经AvaⅡ内切酶酶切后产生T/T、T/ G、G/G基因型,因此当被检个体为G/G基因型时,目的片段被完全切开,电泳可见到 115、98 bp条带;当被检个体为 T/G基因型时,一条片段被切开,而另一条片段不被切开,电泳时可见到 213、115 bp条带;当被检个体为 T/T基因型时,两条片段都不能被切开,电泳仅见213 bp一条条带。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。用Hardy-Weinberg平衡检测基因频率的群体代表性,四格表和R×C列表χ2检验分析两组等位基因和基因型的频率分布差异及发病风险。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对两组每个多态性位点基因型进行了拟合优度χ2检验,结果表明其基因型频率分布未偏离Hardy-Weinberg平衡。各rs754093基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡,故本研究人群基因频率能够代表群体的基因分布。两组NFATC1基因rs754093的基因型与等位基因频率比较见表 1。相对于携带TT基因型,携带GG+TG基因型脑出血发病风险增加51.4%(P=0.030,OR=1.514,95%CI为1.040～2.204);相对于T等位基因,G等位基因脑出血发病风险增加41.1%(P=0.011,OR=1.411,95%CI为1.080～1.843)。

表1 两组NFATC 1基因rs754093基因型和等位基因频率比较

3 讨论

近年来,随着脑出血家族聚集现象的发现,遗传因素在脑出血发病中的作用备受关注,成为研究的热点。目前,已经被证实与脑出血密切相关的因子有血管紧张素转换酶(ACE)[3～5]、血管紧张素受体(AT1R)、凝血因子ⅩⅢ[6]、纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PAI-1)[7]、血小板活化因子转化酶(PAFAH)、纤维蛋白原Bβ链(FgBβ)及载脂蛋白(Apo)B、E和三磷酸腺苷结合盒转运子1(ABCA1)、载脂蛋白H(Apo H)、Endoglin、胱蛋白C、Notch3、N-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、α-Adducin、α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)等。国内外最新研究发现,转录因子NFATC1调控T细胞内的多种因子与血管内膜炎性反应密切相关。其调控的TNF-α等因子与高血压密切相关,调控的COX-2等因子参与AS的形成,调控的Apo B、nur77、SREBP-1a等因子与血脂异常密切相关。血管内膜炎性反应在脑出血的发生发展过程中起着至关重要的作用,高血压是脑出血的独立危险因素,血脂异常和动脉粥样硬化是脑出血的病理基础。血脂异常与高血压、动脉粥样硬化密切相关,三者之间互相影响,互相促进脑出血的发生和发展。由此可见,转录因子NFATC1与高血压脑出血的发生发展密切相关。所以,本次研究将NFATC1作为研究脑出血病因的候选基因。

本次研究的NFATC1基因第9外显子单核甘酸多态性(SNP)rs754093mRNA第2 704位碱基T-G突变,使密码子序列改变(TGT-GGT),从而导致半胱氨酸(Cys)转变成甘氨酸(Gly),这个SNP位点存在错义突变,是功能性SNP。本研究发现,中国汉族人群NFATC1第9外显子上的多态性位点rs754093为T/G二态,存在T/T、T/G、G/G三种基因型。查询http://www.ncbi.nlm.nih.gov中的Population Diversity,发现中国对照组汉族人G/G基因型及等位基因频率与日本人、欧洲人、非洲人比较存在显著性差异,中国汉族人G等位基因频率(0.335)显著低于欧洲人(0.526)及日本人(0.466),而高于非洲人(0.169)。由此可见,NFATC1基因rs754093多态性分布存在种族差异,可能是由于突变、选择、随机遗传漂移、建立者效应或迁移等因素对其的影响造成的,从而导致不同种族或隔离群体等位基因、基因型频率间存在程度不同的差别。我们研究发现, NFATC1基因rs754093多态性与高血压脑出血显著相关,观察组SNP rs754093 G/G基因型明显高于对照组,G/G+T/G基因型携带者较T/T基因型人群发生脑出血的相对风险度为1.514,G等位基因携带者较 T等位携带者人群发生脑出血的相对风险度为1.411。研究表明,rs754093的G/G基因型是高血压脑出血发生的一个独立危险因素,其风险性主要来源于G等位基因。

我们初步研究了中国汉族人群转录因子NFATC1基因第9外显子上的SNP rs754093基因型分布,本次研究为进一步探索转录因子NFATC1与高血压脑出血关系的相应功能学研究奠定了基础,而且如果我们发现更多与脑出血密切相关的转录因子的SNP,将大大缩小探索脑出血致病基因的范围这不仅有助于脑出血高危人群的早期检测,而且可为脑出血预防、治疗和药物设计奠定全新的基础。

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