核酸检测技术在血液筛查中的应用评估及建议

◆ 颜秀娟 邱昌文 石庆秋 谢家日 罗必泰

责任编辑:吴小红

输血相关传染病的预防和控制已成为全球关注的焦点。核酸检测(Nucleic Acid Test，NAT)是一种新兴的血液传染病检测方法，能显著缩短血液感染病毒的“窗口期”，降低经输血传播疾病的风险。但目前关于是否在我国开展NAT血液筛查的争议较大。南宁中心血站血液检测实验室作为广西NAT血液筛查试点实验室，于2010年11月进入试运行阶段。文章结合工作实践，对开展NAT血液筛查的必要性与可行性进行了总结，并提出了相关建议。

1 必要性

1.1 现行血清学检测模式不能保证血液安全

输血传播疾病以病毒传播为主，在我国最引人关注的为 HBV、HCV和HIV。根据我国现行法律法规要求，采供血机构对献血者的病毒血清学检测模式为:用2种不同厂家的EIA检测试剂筛查HBsAg、抗－HCV、抗－HIV［1］。虽 然 这 种筛查模式极大地降低了输血传染疾病的风险，但由于EIA检测的是抗原和抗体，存在“窗口期”、病毒变异以及低水平携带者等漏检［2］。“窗口期”是指从感染病原体到血液中可检测标志物的时期。病原体标志物为抗体或抗原。HBV、HCV和HIV的“窗口期”分别为50～60d、70d 和 40d［2］。有文献表明，美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性均来自“窗口期”感染献血［3］。血清学检测HBsAg、抗－HCV和抗－HIV阴性不能排除HBV、HCV和HIV感染。研究报道表明，EIA检测合格的献血者中，HCV RNA阳性比率为 0.01% ～0.19%，HBV DNA 阳性比率为0.4%～0.92%;在 HBV暴露率 70% ～90%的地区，献血者中有7% ～19%为HBsAg阴性HBV感染者，而HB-sAg阴性HBV DNA阳性血18%可导致输血后乙肝感染［4］。我国是乙肝高流行区，HBsAg携带者率为9.09%，HBV 流行率高达 60%［5］，抗－HCV 阳性率达 3.2%［6］，艾滋病亦处于快速传播阶段。因此，如果按照现行血清学检测模式，传染性病毒经输血传播的形势非常严峻。

1.2 检测试剂敏感性不够易造成漏检

近年来，患者因输血感染乙肝、丙肝或艾滋病而向法院起诉要求血站和医疗机构予以赔偿的案件不断增多。究其原因，检测试剂敏感性不够而造成漏检是重要原因之一。造成EIA检测假阴性的原因有“窗口期”感染、免疫静默感染、病毒变异等。不同病毒感染的“窗口期”长短不同且存在个体差异，并与检测方法及所用试剂的敏感性有关。避免漏检的方法是增加检测标志物和检测项，包括抗原检测和核酸检测2个方面。在病毒感染早期，病毒抗原蛋白的出现要早于抗体，可缩短“窗口期”。可增加的抗原检测项有:(1)HCV核心抗原检测。增加此项检测可缩短HCV感染检测“窗口期”约 40～50d。但 HCV核心抗原检测试剂昂贵，多为进口，国产试剂灵敏度和特异性有待提高。(2)HIV－P24抗原检测。P24抗原检测法较抗体检测可使窗口期缩短1～2周。但单独的P24抗原检测只能用于早期辅助诊断和病情监测［7］。第四代 HIV EIA为 HIVP24抗原和抗体联合检测试剂，但由于同时把抗原和抗体包被在反应板上，存在相互干扰的可能，检测的特异性和敏感性都会受到影响［8］。另外，研究表明，HBV隐匿型感染是一种HBV抗原抗体阴性，HBV DNA低水平复制的慢性无症状乙肝病毒感染广泛存在于普通人群中，是HBsAg筛查漏检的主要原因。因此，在 HBV感染高度流行、抗－HBc不可行地区，HBV NAT筛查是非常必要的［9］。

2 可行性

2.1 NAT自身敏感性极高

NAT是一系列直接检测病原体核酸技术的总称，主要原理是使用物理、化学和生物学方法，通过靶核酸直接扩增或其附带信号扩增的方法，让看不见的极微量的核酸变成直观的光电或可视信号，从而判断标本中是否存在相应的病原体。其敏感性极高，可大大缩短检测“窗口期”［10－11］。美国 2000年血清学检测HIV和HCV的输血感染机率分别低于1:25万和1:130万。NAT技术的应用，使得HIV和HCV因“窗口期”感染的机率降低到 1:200～400 万［1］，极大地降低了经输血传播疾病的风险。另有研究发现，NAT检测可将HBV、HCV和 HIV EIA检测的“窗口期”分别缩短为约25d(缩短45%)、59d(缩短 89%)和 11d(缩短50%)，还可检测出因病毒变异、免疫静默感染、人工操作错误等漏检的污染血液［11］，可有效预防经输血传播疾病。

2.2 现实需要

近年来，我国乙肝、丙肝及艾滋病感染人群呈明显上升趋势。献血者中感染或携带上述病原体的比例较高，临床用血安全面临巨大挑战。引进NAT血液筛查技术，可进一步提高血液安全性，减少输血感染事故的发生，从而增强公众对医疗卫生行业乃至对政府的信心，进而保障社会稳定。到 2010年 6月，北京、上海、杭州、大连、深圳等地血液中心和中心血站已开展NAT血液筛查检测;2008年的北京奥运会、2010年的上海世博会及广州亚运会均引进NAT血液筛查技术，以提高用血安全性。NAT血液筛查技术的优越性已引起国家卫生行政部门的高度重视。2010年全国医政工作会议指出，艾滋病、肝炎等传染病主要是通过血液传播，NAT血液筛查技术相对传统酶免技术而言，具有速度更快、灵敏度更高等优势。会议将北京、上海、广州等地15所采供血机构确立为我国内地首批核酸检测试点单位。NAT血液筛查技术在我国的推广与应用将成必然趋势。

3 建议

3.1 开展成本效益与血液残余风险度分析

由于NAT试剂价格比常规血清学检测试剂要贵得多，因此在探讨我国是否需进行NAT血液筛查时，必须对血液残余风险度进行评估。输血后病毒感染的残余风险度评估是一种借助数学模型的前瞻性研究。研究表明，实施核酸检测筛查血液的发达国家，输血后传播病毒的残余风险度要低于没有实施核酸检测的发展中国家［12］。但对于我国来说，这3种病毒的流行病学特征与国外不尽相同，照搬国外检测模式，存在成本与效益的问题。国内部分血站在血液筛查中对EIA检测阴性的血样进行3种病毒三联核酸检测，都检出了一定比率的HBV抗原阴性DNA阳性的血样，少有HCV和HIV检出的报道，因此在我国采用此种方法进行筛查的成本与效益需进行更深一步地评估。

3.2 检测模式及试剂选择

NAT试剂本身的质量及采用何种检测模式，直接关系到该项技术的实际作用［13］。最初应用 NAT筛查血液时，一般采取混样检测模式以降低成本，但汇集样本数越多，漏检的可能性就越大。因此，国际流行趋势是尽可能小样本混样或单个检测。是否汇集或汇集样本数为多少取决于所用试剂的灵敏度，还与当地献血人群中病毒感染者的阳性率以及病毒载量携带者的比例有关。目前，国外多采取小样本混样或单人份NAT检测;国内试行核酸血液筛查的血站引用技术各有不同，混样规模从50人份到 5 人份不等［10］。

临床诊断和血液筛检是两个不同的应用领域，血液筛检试剂的要求比临床诊断更高。所以，开展NAT血液筛查时应注重试剂本身的质量。应选择灵敏度高、重复性好、特异性好的试剂，尤其是对HBV NAT试剂的灵敏度要求应比HCV及HIV NAT高，以防止低拷贝的病毒阳性的血液漏检。目前，国内开展NAT血液筛查多采用进口试剂，国产NAT试剂尚未广泛应用，主要是因为试剂灵敏度和特异性较低。迄今为止，正式通过美国FDA认证的试剂仅有2种，即Roche S201 MPX 6人份混合检测及Chiron ProcleixTMA技术。但进口试剂的高额成本也限制了其应用。因此，研发出适合我国国情的高灵敏度、低成本的NAT血液筛查试剂是国内采供血机构开展NAT血液筛查的前提。

3.3 实行标本集中化检测

NAT检测不但试剂昂贵，而且对基础设施、检测环境、人员培训和管理模式等都有较高要求，成本很高。目前，有些国家实行标本集中化检测，优势很明显。但在我国要实施标本集中化检测，还存在许多问题有待试点和妥善解决。集中化检测模式可以充分利用资源，提高检测质量和检测效率、降低检测成本，可逐步试行。具体做法可采取打破行政区划及隶属关系，实行地域管理。现代化的交通及通讯为实现这种模式提供了基础，发达地区可优先考虑采取这种模式。以南宁中心血站为例，血站作为广西首府城市血站，即将开展的标本集中化检测得到了政府的大力支持。实验室建设、自动化检测设备购置、人才引进及人员培训等均得到了很好地落实，为开展NAT检测提供了有利条件。

3.4 有符合技术要求的实验室

核酸血液筛查技术是精密的检验技术，易受环境影响。因此，需建设一个符合技术要求的实验室，以保障检验结果的准确性。实验室建设时应注意:血清学检测实验室应与NAT实验室分开，各自独立为2个实验室;NAT实验室的建设应符合《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》相关规定，并符合基因扩增检验实验室区域设置原则。NAT各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区，以防止人员、仪器设备、血样、试剂等交叉污染。

3.5 实验室质量管理体系的建立

对NAT检测的质量管理直接关系到该项技术的实际应用效果。如果没有全面的质量管理，NAT筛查血液不仅可能会漏检，还可能会出现大量假阳性问题。当大量假阳性结果出现后，不仅拆分复查工作费时费力，还会影响正常发血。血液标本的质控是整个检测过程的最关键的控制点之一，对血液检测质量有着至关重要的影响。因此，为确保血液标本的质量，需建立完善的标本留样和处理程序，以保证采集标本的完整性，即正确采集、贮存、运输并正确离心分样等［14］。同时，通过建立标准操作规程，规范NAT检测人员的操作，严格执行防污染措施，可避免样品间的交叉污染和扩增物的污染。

总之，新方法、新技术的应用要考虑检测成本、试剂与仪器设备的配套、人员技术的培训以及对现行法律修订的跟进等。但随着NAT筛查试剂质量的提高和成本的下降，以及我国血液筛查模式的转变、管理水平的提高和经费的落实，我们坚信，血液NAT筛查在我国将有着广阔的前景。

［1］中华人民共和国.GB18467－2001，献血者健康检查要求［S］.2001.

［2］陆志檬，韩永年.进一步控制经血传播的病毒感染［J］.中华检验医学杂志，2001，24(3):135－136.

［3］文国新，美黑丽.血液感染性安全问题的现状与展望［J］.中国输血杂志，2006，19(4):332－334.

［4］叶贤林，曾昭鉴.乙型肝炎病毒核酸筛查近展［J］.中国输血杂志，2007，20(6):537－539.

［5］梁晓峰，陈园生，王晓军.中国3岁以上人乙型肝炎血清流行病学研究［J］.中华血液学杂志，2005，26(9):655－658.

［6］戴志澄.中国病毒性肝炎血清流行病学调查［M］.北京:北京科技文献出版社，1997.60－68.

［7］杨 振，祁自柏，于 洋，等.窗口期丙型肝炎病毒感染样品抗原检测意义分析［J］.中国预防医学杂志，2008，9(9):793－797.

［8］金 燕.艾滋病的检测技术及其研究进展［J］.旅行医学科学，2007(13):1－5.

［9］叶贤林，周一炎，杨立新，等.血液HBV DNA全自动检测及基因分型分析［J］.中国输血杂志，2005，18(2):94－96.

［10］任芙蓉.核酸检测技术在国内外血液筛检中的应用［J］.北京医学，2008，30(8):561－564.

［11］王 迅，郑 岚，张 颖，等.核酸扩增技术(NAT)在上海血液筛查中的初步应用［J］.中国输血杂志，2003，6(3):157－160.

［12］张孝山.NAT技术筛查血液后输血传播病毒感染的残余危险［J］.中国医学检验杂志，2006，7(2):138－140.

［13］叶贤林，曾昭鉴，杨宝成，等.国产核酸扩增(PCR)试剂在献血者血液HBV DNA筛查中的应用研究［J］.中国感染控制杂志，2007，6(5):301－306.

［14］颜秀娟，李 忠，李 彬.血站检验科关键控制点质量管理的探讨［J］.基层医学论坛，2009，13(2):156－158.