我国凝乳酶产生菌育种的研究进展

张超垒，王成忠，张志国,2,张玲梅

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院,济南 250353；2.南京农业大学食品科技学院,南京 210095；3.山东龙大植物油有限公司，山东聊城 252000）

我国凝乳酶产生菌育种的研究进展

张超垒1，王成忠1，张志国1,2,张玲梅3

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院,济南 250353；2.南京农业大学食品科技学院,南京 210095；3.山东龙大植物油有限公司，山东聊城 252000）

综述了目前我国在凝乳酶产生菌在自然选育、诱变育种和基因工程育种这3方面的研究进展情况。

微生物凝乳酶；自然选育；诱变育种；基因工程育种

0 引言

随着人们生活水平的提高及生活观念的转变，奶酪生产行业得到了很快的发展，与之相关的凝乳酶生产行业也发生了很大的变化：到目前为止，在酶制剂行业，凝乳酶已跃居成为世界第二酶制剂[1]；生产凝乳酶的方法也从小牛皱胃提取法发展到了植物组织提取法和微生物发酵生产法。利用微生物生产凝乳酶，发酵周期短、产量大及成本较低，在酶制剂生产行业得到广泛认同，与此同时凝乳酶产生菌育种的研究也日渐兴起。

1 凝乳酶简介

1.1 凝乳酶及其分类

凝乳酶是一种能使牛乳凝固的酶。传统意义上的凝乳酶是小牛皱胃酶，它以前体的形式合成，经过剪切形成具有323个氨基酸残基的活性凝乳酶分子，等电点为4.2，分子量为40 500 u。小牛皱胃酶，具有酸性蛋白酶家族的类二折叠对称的特点，分子可分为由1～175氨基酸残基组成的N端区域和由176～323氨基酸残基组成的C端区域，在N端区域和C端区域的分离裂沟底部发现两个天冬氨基酸活性位点，Asp-34和Asp-216。凝乳酶分子中，氨基酸残基和水分子在活性位点形成广泛的氢键网状结构以维持凝乳酶的类二折叠对称结构；二硫键Cys-250和Cys-283，对酶的活性有重要影响[2]。

根据凝乳酶的来源，可把凝乳酶分为动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。动物凝乳酶，可从牛、猪和羊的胃中获取：刘文宗等[3]发现乳猪胃酶具有凝乳性；张富新等[4]通过实验证实羔羊皱胃酶也有较低的凝乳性。许多植物蛋白酶能使牛乳凝固，张富新等[4]利用木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶与小牛皱胃酶和羔羊皱胃酶制得了较理想的干酪；纪丽莲等[5]发现牛乳中添加5%生姜蛋白酶粗提物，60℃保温4 min可使牛乳凝固；张寒冰等[6]用姜汁和胃蛋白酶混合制作了各项指标都较好的干酪。微生物凝乳酶的研究始于自20世纪50年代末,主要在美国、日本、西德、丹麦等国进行，所用菌种主要有栗疫菌、毛霉、微小毛霉和蜡状芽胞杆菌等[7]；自1964年Arima发现Mucor pusillus可产生高活力凝乳酶以来，已有许多科学家发现产凝乳酶的新菌种，到目前为止，发现的产凝乳酶微生物达40余种[8]。

1.2 凝乳酶的凝乳机制

牛乳在凝乳酶作用下凝固，是由酪蛋白变化而引起的。牛乳中酪蛋白可分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。在酪蛋白胶体中，它们对于Ca2+的敏感程度不同，αs-酪蛋白易受Ca2+的影响而沉淀；在室温以上并有Ca2+存在时，β-酪蛋白也形成沉淀；而κ-酪蛋白不仅本身稳定，且还具有抑制αs-酪蛋白及β-酪蛋白在Ca2+影响下沉淀的保护作用。牛乳中酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒能保持相对稳定的胶体悬浮液状态是与κ-酪蛋白的胶体保护作用是密切相关的。凝乳酶的凝乳过程可分为两步：第一步，凝乳酶专一性水解乳中κ-酪蛋白的敏感键Phe105-Met106键，使其生成副κ-酪蛋白和糖巨肽；第二步，当总κ-酪蛋白被水解掉约85%时，生成的副κ-酪蛋白在Ca2+的存在下引起凝固，而对Ca2+稳定性差的αs-酪蛋白及β-酪蛋白，丧失了酪蛋白的胶体保护作用，随副κ-酪蛋白聚集，形成凝胶体系。凝胶形成网络，凝胶中的水分通过脱水收缩排出[7]。

2 微生物育种的方法

微生物育种，指培育优良微生物的生物技术，它是提高产品产量和质量的一条有效途径，通常可分为自然选育和人工育种两大类。

2.1 自然选育

自然选育是指对自然界中的微生物，在未经人工诱变或杂交处理的情况下进行分离和纯化，然后进行纯培养和测定，选择优良的菌株进行保藏。自然选育简单易行，可达到纯化菌种，防止菌种退化，提高产量的目的，但在自然条件下基因发生突变的几率特别低，所以选育效果不是很理想[9]。自然选育沿用多年，至今仍是工业微生物育种的手段之一。

2.2 人工育种

诱变育种是利用物理或化学因素处理均匀分布的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以获得供科学实验和生产实践使用的理想突变菌株[10]，它是发酵工业中的提供优良高产菌株的经典方法。代谢控制育种是在诱变育种的基础上，获得各种解除或绕过了微生物正常代谢的突变株，人为地使有用产物选择性地大量生成累计，并且在有控制的条件下培养，大量地生产这种有用产物[11]，它打破了微生物调节的控制机制，将有用的代谢产物得到大量积累。杂交育种是在诱变育种基础上利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式，而导致其菌株间的基因的重组，把亲代的优良性状集中在后代中的一种育种技术[9]。基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需供体生物的某一遗传物质提取出来，离体条件下用适当工具酶进行切割后，与载体连接,然后导入另一细胞，使外源遗传物质在受体细胞中进行正常复制和表达，是当前最先进的育种技术[12]。

3 我国凝乳酶产生菌的育种

3.1 自然选育

自然选育凝乳酶产生菌，运用常规纯培养技术对自然条件下的微生物进行分离纯化，再进行筛选得到产凝乳酶的优良菌种。虽然自然条件下基因发生突变的几率很低，选育优良菌株的可能性不大，我国学者仍然在此方面做了很多有益的尝试。郭光远等[13]在对云南不同地区的湖泊采集土样、湖底泥和水样，进行分离纯化，得到2502株放线菌、真菌、细菌进行了凝乳酶产生菌的筛选，结果发现放线菌中链霉菌属（Streptomyces）、小单胞菌属（Micromonospora）、马杜拉放线菌属（Actinomadura）等和9.8%的真菌及8.8%的细菌中都有一定的凝乳酶酶活力。刘振民等[14]从酒药中筛选出一株凝乳酶高产菌株,并对其进行产酶条件研究,结果表明:土豆汁培养基是适宜产凝乳酶培养基,培养基起始pH值为6.43～6.51,培养时间为59～64 h,培养温度为34～35℃,该菌株的凝乳酶活可以达到80 SU/mL。蒋咏梅等[15]从104份土样中分离到一株产豆凝乳酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)。孙健等[16]从17株产凝乳酶的霉菌中初筛到产酶量较高的总状毛霉(Mucorracemosus)菌株。李子木等[17]从14种酒曲中分离纯化出了18株菌株,其中8个具有凝乳酶活力，采用酪蛋白平板法和Arima时间法筛选出了1株产生凝乳酶能力强的菌株。宋曦等[18]从天祝放牧牦牛生活环境土壤中分离出一株产凝乳酶细菌，并对其进行了鉴定，为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其在麸皮培养基中发酵72 h产凝乳酶活力高达89.56 SU/mL，蛋白水解力为21.27 U/mL。吴进菊等[19]从中国曲中筛选出一株凝乳酶高产菌株Rhizopus arrhizus F34，研究得出该菌株产酶的最佳发酵培养基为：米粉麸皮水解液4.5%，黄豆粉水解液4.0%，CaCl20.3%，KCl 0.5%；最佳培养条件为：初始pH 4.5，培养60 h，此时凝乳酶活力可达161.14 SU/mL凝乳酶活力与蛋白酶活力比值为27.88。范素琴[20]从红曲米中筛选出一株凝乳酶产生菌，研究显示马铃薯葡萄糖培养基是该菌最佳培养基,正交试验得出该菌最佳培养条件为：温度30℃,转速为160 r/min,振荡培养72 h,此条件下凝乳酶活力可达150.6 SU/mL。

3.2 诱变育种

诱变育种，根据所用的诱变剂不同可分为物理诱变育种和化学诱变育种。常用的物理诱变剂为辐射中的各种射线，包括紫外线、X-射线、γ-射线、快中子、α-射线和宇宙线等；化学诱变剂是一类能对DNA起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质，包括碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、金属盐类及其他化学诱变剂[11]。诱变育种具有一定的盲目性，但仍是微生物育种最基础的育种手段。对于凝乳酶产生菌的诱变育种，我国学者进行了大胆的探索，获得了具有应用价值的优良菌种。孙健等[16]以初筛得到的一株产酶量较高的总状毛霉为出发菌株，对其进行了不同剂量60Co照射，筛选到一株变异菌株R132，凝乳活力提高了80%。郭光远等[13]选定一株毛霉(Mucor sp.)代号Y85-8512和一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)代号Y85-8501作出发菌，经诱变育种，得到凝乳活力分别可达到5 000 SU/g和10 000 S U/g的稳定高产菌株。蒋咏梅等[15]以从土壤中筛选到的一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)为出发菌株，先进行紫外照射，后经硫酸二已酯处理，诱变获得一株凝乳酶高产菌株，对其优化培养基组成成分，凝乳酶活力提高5倍以上。邵淑娟等[21]对产凝乳酶的黑曲霉进行微波辐照，酪蛋白培养基凝乳圈初筛，基础培养基固态发酵复筛，诱变选育出遗传稳定的突变株WB6-3、WB2-5，凝乳活力分别比出发菌株提高了35%和14%。

3.3 基因工程育种

基因工程育种往往是先得到目的基因，然后选择载体，准备载体并与目的基因连接成重组DNA，转化、转导或转染受体细胞，最后是利用遗传标记和分子生物方法等筛选具有表达目的基因功能的重组体，从而构建具有特殊功能的基因工程菌。基因工程育种则实现了微生物选育的理性化，人们运用此手段可以定向地孕育新的微生物菌种。在基因工程育种凝乳酶产生菌方面,我国在对表达载体以及启动子的筛选方面做了研究[22]。王志林等[23]通过设计一对特异性的引物,采用RT-PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,选育出了携带木瓜凝乳酶基因大肠杆菌。张渝英等[24]应用含有tac启动子和牛凝乳酶B基因的表达质粒pTaAC进行了构建，并转化到大肠杆菌JM105中，凝乳酶原基因的表达受温度和加入的IPTG诱导剂所调控，活性酶产量达到14～20 mg/L。王革等[25]研究表明核糖体结合位点（RBS）的二级结构在原核生物中是决定翻译起始的一个关键因素,为了避免使用价格昂贵的诱导剂IPTG及进一步提高牛凝乳酶原基因表达水平,采用PRPL启动子取代Tac启动子，构建一套带有trp启动子的表达质粒，通过变异翻译起始区段，可使大肠杆菌表达凝乳酶达到总细胞蛋白的39%。张莉等[26]从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列，将其克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin，为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。孙大庆等[27]从克隆载体pS19-PPC中获得牛凝乳酶原基因,将该基因与表达载体pNZ8148连接，转化乳酸乳球菌NZ9000,转化子经酶切、PCR和测序鉴定后,用nisin进行诱导表达,表达产物纯化后检测，其凝乳活性可达2×103mL-1（国际凝乳酶活数）。姜媛媛等[28]将克隆到微小毛霉凝乳酶基因，插入原核表达载体pTWlN1中，使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合，获得原核表达质粒pTWIN1/M，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了重组蛋白。

4 展望

随着经济全球化进程的加速，奶酪的营养价值得到了人们的认同，在奶酪制造工艺成熟和其潜在消费市场巨大的前提下，我们需要优良凝乳酶产生菌用于凝乳酶制剂的生产。在选育凝乳酶产生菌方面，我们要做好以下工作：（1）筛选更多的优良菌种来生产凝乳酶；（2）利用传统诱变选育凝乳酶高产菌株，用于凝乳酶制剂的工业化生产；（3）获得非正常代谢的突变株，人为使凝乳酶选择性地大量生成累积，并且在有控制的条件下培养，大量地生产凝乳酶；（4）在诱变育种基础上利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式，把亲代的优良性状集中在产凝乳酶菌株上；（5）寻找更好的载体、宿主细胞和启动子，不断提高凝乳酶在受体细胞中的表达率效率。相信伴随着微生物育种技术的进步和凝乳酶需求量的剧增，凝乳酶产生菌的育种会在我国得到很好的发展。

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Rearch advancement of the strain breeding which can produce chymosin in China

ZHANG Chao-lei1，WANG Cheng-zhong1，ZHANG Zhi-guo1,2，ZHANG Ling-mei3
(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China;2.College of Food Science and technology，Nanjing Aragricultural University,Nanjing 210095,China;Shandong LongDa Plant Oil Co.,Ltd.,Liaocheng 252000，China)

.In terms of natural screening,mutation breeding and the breeding of gene engineering,this paper reviewed the rearch advancement of the strain breeding which can produce chymosin in China.

microbial chymosin；natural screening；mutation breeding；the breeding of gene engineering

Q935

B

1001-2230（2011）04-0036-03

2010-09-29

张超垒（1983-），男，硕士研究生,研究方向为食品资源开发。

王成忠