抗乙型肝炎病毒治疗研究进展

张 洪 李青梅 闫红青 袁华魏 姜艳芳 牛俊奇 (吉林大学第一医院肝胆胰内科，吉林 长春 3002)

乙型病毒性(MBV)肝炎是由HBV引起的传染性疾病。目前全世界约有4亿HBV携带者，我国是乙肝高发区之一，约有HBV携带者1.3亿人，每年约有30万人死于慢性肝炎(CHB)，其中70%的病毒性肝炎是乙型肝炎〔1〕。卫生部2008年传染病疫情统计数据显示，我国乙型肝炎发病总数居传染病发病总数的第二位，其死亡总数居第四位，与2007年同期比较，乙型肝炎死亡率呈上升趋势。抗病毒治疗的目标是最大限度地抑制或消除HBV，减少和防止肝脏功能失代偿、肝硬化、肝细胞癌及其并发症的发生，改善患者生活质量并延长其存活时间。现有抗HBV药物很少能对cccDNA(covalently closed circular DNA)有降解作用，即使DNA链合成终止，病毒仍能以cccDNA为模板，转录mRNA并继而翻译病毒蛋白。针对HBV复制的特点，抗HBV主要有以下两种策略:(1)打破免疫耐受，提高人体免疫功能，通过细胞溶解机制和非细胞溶解机制，清除细胞内的cccDNA;(2)通过长期、有效的抗HBV药物和治疗方法抑制新的HBV合成，使细胞内的cccDNA库得不到补充而逐渐耗竭〔2〕。针对HBV难治性，随着抗HBV药物不断出现，本文对抗HBV措施研究做一综述。

1 抗HBV的药物治疗

在目前抗HBV治疗中，药物治疗是临床应用的重点，主要分为生物类药物、化学类药物和中草药及有效成分3类。

1.1 生物类药物 ①干扰素(IFN):IFN与肝细胞表面的同种受体结合，经细胞内信号传导，激活干扰素激活基因，主要作用是降解HBV复制的中间体mRNA，来抑制病毒mRNA信息的传递以及病毒蛋白的翻译，从而阻止病毒在宿主细胞内繁殖。IFN抗病毒作用比较广泛，对CHB治疗长期有效〔3〕。同时它还能增加在e抗原(HBeAg)阴性CHB患者体内表面抗原(HB-sAg)抗原清除率。IFN治疗可改善CHB患者的长期预后，持续应答者发生肝癌的危险性及死亡率明显降低。但近期研究表明，IFN用于治疗HBeAg阴性CHB患者有效率为38% ～90%，但停药后复发率较高，仅20% ～25%的患者有长期疗效〔4〕。同时IFN价格昂贵和副作用明显，限制了IFN应用。②胸腺肽α1:免疫调节剂可以提高人体的免疫功能，尤其是对HBV的特异性免疫。可以识别和破坏HBV感染的靶细胞，清除HBV。α1胸腺肽是人工合成的多肽，由28个氨基酸组成。α1胸腺肽的作用机制可能是激活了HBV特异辅助性T细胞，增强机体对病毒抗原的体液免疫。通过分泌各种细胞因子，以及加强IL-22(interleukin 22)受体的表达，诱导细胞毒性T细胞免疫。它为CHB患者提供了新的治疗选择，但从目前的研究结果来看，其有效率还不甚理想〔5〕。

1.2 化学类药物 化学类药物分为核苷类药物和非核苷类似物

1.2.1 核苷类药物 核苷类化合物的主要作用机制是抑制HBV DNA聚合酶，导致前基因组RNA无法反转录为DNA;或与某种dNTP竞争参与HBV DNA合成，整合后终止病毒DNA的延伸。核苷类似物能抑制病毒，并不能清除乙肝病毒，对乙肝病毒cccDNA没有作用，肝细胞内的HBV能否消除取决于机体的免疫清除能力〔6〕。①拉米夫定(贺普丁，3TC):与脱氧核糖胞苷三磷酸(dCTP)竞争参与HBV DNA合成，整合后终止病毒DNA的延伸，抑制病毒复制、肝脏组织炎症、肝脏组织纤维化进展。在肝移植和HIV阳性患者中也有效果。3TC模拟的是胞嘧啶，其结构与人天然胞嘧啶结构不同，只能作用于病毒，而对人体没有毒性作用。3TC治疗乙肝存在两大问题:一是停药后反跳问题，二是耐药性问题。YMDD变异可导致3TC疗效下降，与临床耐药，肝炎复发有相关性。Thompson等用3TC治疗乙型肝炎时，发现HBV前核心基因变异、治疗6个月时还有持续高病毒血症以及女性患者更容易发生3TC耐药〔7〕。②阿德福韦酯(贺维力):为腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韦(Adefovir，PMEA)的前体药物，具有抑制对3TC产生耐药的HBV DNA多聚酶的活性。体内外研究结果表明，阿德福韦酯对HBV野生株和YMDD变异株均有显著抑制作用〔8〕。对HBeAg阳性CHB患者在抑制HBV DNA复制同时，能提高HBeAg转阴率和血清转换率，并使得ALT复常率明显提高，而且可以维持对肝病的长期控制。但是HBV对阿德福韦酯也产生耐药突变，经典突变有rtN236T和 rtA181V/T，同时rtN118H和rtM207V变异也在阿德福韦酯耐药患者内发现〔9〕。③恩替卡韦(博路定):其抗病毒作用通过三个方面对HBV的复制进行抑制:聚合酶的引发、负链的逆转录及正链DNA的复制。临床研究表明恩替卡韦能有效选择性抑制HBV DNA复制，疗效优于3TC，治疗CHB患者12 w后，HBV DNA转阴率明显优于阿德福韦酯，但ALT复常率无明显差异〔10〕。Reijnders等发现恩替卡韦对没有用过核苷类药物的患者是有效的，应答率是79%，对于以前用过阿德福韦酯无论是否发生耐药的患者都有效。但是该药物对于3TC发生耐药患者治疗后应答率低于没有发生耐药人群。常见不良反应为头痛、上呼吸道感染、上腹痛和呕吐等症状〔11〕。④替比夫定(Telbivudine，素比伏)为天然胸腺嘧啶脱氧核苷的自然L型对应体，是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷类抗HBV DNA多聚酶药物。替比夫定5'-腺苷通过与HBV天然底物胸腺嘧啶的5'-腺苷竞争，从而抑制HBV DNA多聚酶的活性以及通过整合到HBV DNA中造成HBV DNA链延长的终止，从而抑制HBV的复制。替比夫定同时抑制HBV DNA第一链和第二链的合成。该化合物在体外可以有效地且有选择性地抑制人肝肿瘤细胞株中的HBV。已经结束的多中心、随机双盲的Ⅱb期临床研究表明，单用Telbivudine或联合3TC治疗HBV感染的效果明显优于3TC。但是替比夫定治疗1年后有5%的患者发生了HBV突变(rtM204I)〔12〕。

1.2.2 非核苷类似物 非核苷类HBV选择性抑制剂的研究尚处于起步阶段。目前还没有有效的非核苷类HBV选择性抑制剂上市。但由于这类化合物活性高，为抗HBV药物的设计提供了很好的依据。①苯丙氨衍生物:对野生型和3TC耐药的HBV变种有较好的抑制作用，半数抑制浓度为2.4 μmol/L。其抗病毒机制可能是抑制带有病毒壳体蛋白信息的mRNA的合成〔13〕。②苯并咪唑衍生物:Yun-Fei Li等合成苯并咪唑一系列衍生物，试验发现12a和12b具有最强抗病毒活性和低毒性。半数抑制浓度分别为0.9和0.7 μmol/L以及选择指数分别为＞1 111和714〔14〕。③杂多化合物:新型多酸化合物具有较好的抗HBV的活性，并且其体外毒性低。对细胞外HBV DNA的50%抑制浓度(IC50)和90%抑制浓度(IC90)分别为13.42、59.47 mg/L。各浓度实验组对HBeAg和HBsAg分泌的抑制率均高于对照组阿德福韦酯(P＜0.05)。受试多酸化合物对HepG2.2.15细胞的50%致死浓度(CC50)值为2 899.21 mg/L〔15〕。新型稀土杂多化合物显示出很好抗 HBV活性。受试物对HepG 2.2.15细胞的半数中毒浓度为1 890.46～1 052.3 μg/ml;对 HBeAg和 HBsAg分泌最高抑制率分别达90.6%和95.1%;对细胞外HBV DNA抑制率最高可达67.68%，优于阿德福韦酯等阳性对照药物〔16〕。体内选用鸭乙肝动物模型，初步实验结果表明受试物对DHBV DNA有明显抑制作用，停药10 d后血清中HBV DNA含量保持不变。

1.3 中草药及有效成分 ①苦参素:从中药苦豆子中提取的氧化苦参碱(Oxymatirne，OM)水溶液，有调控免疫、稳定肝细胞膜、阻断肝细胞凋亡、防止肝纤维化等作用。氧化苦参碱能够抑制热应激蛋白70(Hsc70)，而Hsc70能够促进HBV DNA复制。在没有产生细胞毒性剂量下氧化苦参碱抑制该蛋白质mRNA转录和HBV DNA复制分别达到80%和60%。对HBV DNA抑制机制是在逆转录过程。对3TC，阿德福韦酯和恩替卡韦耐药的HBV病毒有效〔17〕。②叶下珠:研究表明不同叶下珠品种和制剂在体外均有不同程度的抗HBV活性，而未显示明显细胞毒性，相同剂量下，药物对HBsAg和HBeAg的抑制比HBV DNA抑制效果好，提示药物对病毒颗粒产生的抑制不仅在转录前水平，可能对mRNA翻译水平、蛋白分泌等环节也有影响〔18〕。③猪苓多糖:从猪苓的菌核中提取的一种葡聚糖，可增强正常人外周血单核细胞(PBMC)中免疫细胞的杀伤活性，增强其所诱导的PBMC表达IL-22受体，并促进其分泌IL-22。在HBsAg转基因小鼠腹腔注射猪苓多糖，结果HBV mRNA的转录水平降低，HBsAg表达下调，表明猪苓多糖对HBV转基因小鼠HBsAg的表达有一定抑制作用。临床上使用猪苓多糖与乙型肝炎疫苗或 IFN联用均取得了很好的疗效〔19〕。④MAP30:20世纪90年代Sylvial Lee-Huang等从苦瓜子中提取的一种植物蛋白，将MAP30作用于HepG2.2.15细胞，结果表明MAP30有明显抗HBV活性，对细胞外HBV DNA均有抑制作用，也可抑制抗原分泌〔20〕。⑤水芹黄酮(Oenanthe javanica flavone):在HepG2.2.15细胞系中IC50为2.28 g/L，最大无毒性浓度为1 g/L。在鸭HBV感染模型中，灌胃给药，1 g/kg浓度剂量给药，在5和10 d时对病毒抑制率为54.3%和64.5%。以上均显示出较强抗病毒活性〔21〕。⑥咖啡鞣酸，奎尼酸和咖啡酸在HepG2.2.15细胞和鸭HBV模型中都显示很好抗HBV的活性〔22〕。

2 抗HBV的基因治疗

在新型抗HBV治疗策略中，基因治疗是研究的热点领域之一。基因治疗即通过对HBV复制、转录环节中关键的酶或RNA分子进行阻断来达到抑制病毒复制的目的。目前，抗HBV的基因治疗技术主要有DNA疫苗、反义核酸、RNA干扰技术等。

2.1 DNA疫苗 DNA疫苗是20世纪90年代开发出来的。它可以通过特定的基因表达产物使机体产生细胞免疫和体液免疫。这种在宿主体内表达抗原的免疫过程与自然免疫相似，可以提呈天然构象的HBsAg，无抗原表位的改变;并且具有长期记忆免疫反应，不但能用于预防，且可用于治疗。Betancourt等在人类身上试验了HBV DNA疫苗的安全性和免疫原性。证实该疫苗能被很好耐受，能刺激机体产生抗体〔23〕。

2.2 反义核酸 反义核酸是一种以抑制特定基因表达为目的基因治疗药物，分为反义核苷酸、核酶和肽核酸〔24〕。①反义寡核苷酸(ASON):ASON依据碱基配对原则特异地结合基因组的双链DNA或单链mRNA，形成部分双链或三链核酸，从而定点封闭靶基因，阻断特定基因的表达。RNA-DNA杂交体还可以激活RNAseH使RNA降解，抑制其表达。②核酶:能特异性结合并切割病毒RNA而不影响宿主细胞RNA，即核酶具有反义活性和RNA切割活性双重作用。由于核酶基因可以通过不同的病毒载体在靶细胞内持续地表达，因而克服了直接注射反义DNA所引起的细胞毒性和被降解等问题。③肽核酸(PNA):PNA于1991年由哥本哈根大学的Neilsen等首先设计合成，是DNA或RNA的类似物。这种经过修饰的寡聚核苷酸对DNA或RNA有着高度的亲和性和专一性。

2.3 RNA干扰技术(RNAi)RNAi是一种新型基因阻断技术，主要利用双链RNA诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制，从而抑制特异目的基因表达。短双链RNA(siRNA)具有其他核酸分子所无法比拟的优势，可能会成为最有潜力的抗HBV基因治疗策略〔25〕。

2.4 其他 He等用美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抗HBV，体外实验显示10 μg/ml PAP明显抑制 HepG 2.2.15分泌 HBsAg，HBeAg和 HBV DNA，抑制率分别为20.9%，30.2%和50%。同时把能表达PAP真核生物表达系统和表达HBV的质粒共转染HepG2，试验结果表明对HBV DNA抑制率为74.0%，高于3TC 抑制率63.0%〔26〕。

3 抗HBV的联合治疗

针对现今抗HBV药物或手段具有的局限性，越来越多的抗HBV治疗研究倾向于将不同作用机制的药物或方法联合或序贯使用。Johnson〔27〕等对IFNα与3TC可能的相互作用进行了研究，结果表明，它们对细胞系中HBV的复制过程有显著的协同抑制作用，联合用药优于单一用药。IFN加苦参碱治疗慢性乙型肝炎能起到互补及协同作用，对改善自觉症状及恢复肝功能等均有较好疗效，且不良反应少。3TC与泛昔洛韦联合治疗慢性乙肝患者，结果表明，两者的联合治疗较3TC单一治疗有显著的优越性〔28〕。

4 病毒性肝炎抗病毒治疗存在的问题

病毒性肝炎的抗病毒治疗，目前存在疗效不够满意，复发率高，有的药物毒性较大和药价昂贵等问题。疗效不够满意的原因有以下几个方面:①目前应用的抗HBV药只能抑制病毒复制而难以清除病毒。同时肝炎病毒为细胞内寄生和复制，抗病毒药物在细胞内不易达到有效浓度，因此影响抗病毒效果。肝炎病毒如HBV除在肝细胞中复制外，还在其他组织如胆管、胰腺、淋巴细胞等处复制。抗病毒药物较易清除血中的肝炎病毒，而组织细胞中的肝炎病毒不易被清除，成为复发的重要原因。②HBV DNA在复制过程中，以cccDNA作为复制的原始模板，而cccDNA半衰期长，不易自然降解;目前抗病毒药物尚不能彻底清除cccDNA。一旦停药后，cccDNA可以作为HBV复制模板，重新转录复制，成为复发的重要原因。③肝炎病毒HBV易发生变异，变异病毒常对抗病毒药发生耐药或疗效不好，如HBV前C区和C区启动子变异株感染，IFN治疗效果差。3TC治疗后的YMDD变异株感染，可发生耐药等。④CHB患者，常对HBV产生免疫耐受和免疫功能低下，使抗病毒药治疗效果不佳。⑤HBV DNA可与宿主细胞染色体DNA整合，整合后的HBV DNA不易被抗病毒药清除。

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