高原藏系绵羊EPAS1基因的克隆以及组织表达研究

乌仁塔娜 刘 芳 白振中 嘎 琴 格日力

（青海大学医学院高原医学研究中心，青海 西宁 810001）

EPAS1是哺乳动物机体功能在缺氧条件下的重要氧依赖转录激活因子。其蛋白属于bHLH-PAS转录因子家族成员，由氧敏感的α亚基和核内稳定表达的β亚基以异源二聚体形式存在。近来越来越多的研究发现，EPAS1参与诸多低氧有关的下游基因的表达调控，从而在低氧调控机制中发挥重要作用[1,2]。因此结合我们正在开展的有关低氧获得性习服相关的研究，对青藏高原获得性习服物种藏系绵羊EPAS1的基因进行了克隆及序列分析，以便为进一步研究高原获得性习服以及急慢性高原病的发病机制的研究提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2009年4月在青海省可可西里国家级自然保护区（海拔4300m）捕获雄性藏系绵羊10只，捕捉后立即运至格尔木市（海拔2800m）解剖取藏系绵羊各组织，迅速投入液氮容器中，低温保存并运回西宁。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及鉴定

按照Trizol试剂盒说明提取藏系绵羊肺组织总RNA，溶于20μL DEPC水中，并用DU800核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值及浓度，并进行1%甲醛变性凝胶电泳检测其质量，置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 目的基因扩增及序列测定

引物设计：利用GenBank中人、小鼠、大鼠、牛和牦牛的EPAS1 cDNA序列用ClustalW进行同源性对比。

目的基因的扩增：取总RNA 2.0μg，按照AMV逆转录酶试剂盒逆转录合成cDNA第一链。PCR反应体系：模板cDNA 1μL，PCR Master Mix 15μL，EPAS1上下游引物各1μL，加水补足至25μL；扩增条件为：95℃预变性5min后进行35个循环，每循环95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，循环结束后72℃延伸10min。取PCR产物10μL 进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳，采用紫外凝胶成像分析系统记录电泳结果。

PCR产物的回收、纯化及序列测定：用 QIAquick Gel 回收试剂盒回收纯化456bp PCR扩增片段并连接到 pGEM-T Easy载体上。通过蓝白斑筛选实验挑取白斑单克隆，接种后37℃摇床过夜，然后提取质粒，用EcoRⅠ酶切电泳，选出含有目的片段的阳性克隆送上海英俊生物生物技术有限公司进行序列测定。将获得的基因序列在GenBank上进行Blast初步比较分析和在ClustalX上进行物种同源性比较。

1.2.3 荧光定量PCR

采用CluxtalW软件对人、大鼠、小鼠、牛的Beta- actin，EPAS1，EPO的序列进行同源性比对。定量PCR由iCycler 定时定量PCR仪来完成。结果显示溶解曲线只出现一个主波峰，说明PCR扩增的特异性较高，符合实时荧光定量的技术要求。

2 结 果

2.1 目的基因的PCR扩增及测序结果分析

用DNAMAN软件，将藏系绵羊EPAS1基因测序序列与其他物种进行同源性比较分析，结果显示与人、大鼠、小鼠、牛的EPAS1基因的同源性分别达到了94%、91%、92%、98%的同源性。

2.2 荧光定量PCR（ΔΔCt方法）检测结果

以β-actin为内参基因，计算藏系绵羊各个组织的EPAS1的ΔCt。可以看出EPAS1基因mRNA的表达量在心脏中最高，约是肺脏的1.8倍，在肝脏中表达量的2.5倍，约是在肾中表达量的7.57倍。

3 讨 论

本研究应用RT-PCR技术首次从草地藏系绵羊肝脏中获得了EPAS1基因的部分编码区序列，为进一步研究藏系绵羊EPAS1的表达及其与高原地区获得性习服机制的研究提供了基础。我们进行了EPAS1 mRNA在藏系绵羊的心、肾、肝、肺组织中的表达，发现EPAS1基因mRNA在藏系绵羊心脏组织中表达量最高。故可认为在藏系绵羊中EPAS1基因的在心脏中的高表达可能与其在低氧环境下藏系绵羊的心脏保护性改变有着重要的关系。

综上所述长期适应高海拔低氧的获得性习服物种藏系绵羊，对低氧已经形成了部分适应性改变，且在分子水平，生理水平，形态水平已经有了一定的改变，这对青藏高原移居物种在低氧习服机制的研究有着重要的价值。通过对藏系绵羊EPAS基因的研究，可以有助于对慢性高原病的发病机制的研究提供理论依据。

[1]管峰,石国庆,刘守仁,等.角蛋白家族及其对羊毛生长发育的调控[J].生命的化学,2007,27(1)：92-94.

[2]谢馥交,卢向阳.克隆全长cDNA的方法及其在兽药研究中的应用[J].中国兽药杂志,2006,40(5)：43-47.