HPLC测定宫炎康颗粒中阿魏酸的含量

刘倩 丁秋玲 包莉 张凤龙

宫炎康颗粒处方由当归、川芎、赤芍、香附、红花、延胡索等十二味中药材组成，为中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第二十册所收载，具有活血化瘀，解毒消肿的功效，用于慢性盆腔炎等症。原标准中仅有芍药苷的薄层鉴别[1]，由于当归、川芎为方中君药，其有效成分均为阿魏酸，其作为一种指示性的化合物[2]，在药材中含量相对较易测定。有关阿魏酸含量测定报道的方法有薄层扫描法[3]、高效毛细管电泳法[4]和高效液相色谱法[5-8]等，由于宫炎康颗粒处方成分复杂、含糖量高，测定时干扰较大，因此笔者采用了多次萃取分离并用高效液相色谱法测定该制剂中阿魏酸含量的方法，该法可有效排除干扰物质，杂峰很少，灵敏度高，结果准确可靠。

1 仪器、试药和色谱条件

1.1 仪器与试药 日本岛津LC-10Ap高效液相色谱仪、SPD-10AP紫外检测器。浙江大学N2000色谱工作站，AEU-200电子天平(日本岛津);CBID960A超声波清洗器(上海科导超声仪有限公司)，TU-1810紫外可见分光光度计。

阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110773-9910)，实验中中药材均购于常州安泰大药房，经鉴定均为药典正品;宫炎康颗粒(自制，批号:20101001，20101002，20101003);乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件 色谱柱:KromasilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈-水(H3PO4调 PH 至2.5)(20:80)，流速:0.8 ml/min;检测波长为313 nm;柱温:25℃。理论塔板数按阿魏酸峰计，不应低于3000。

2 方法与结果

2.1 供试品提取方法的选择

2.1.1 供试品提取溶剂的选择 取本品研细，取3份，每份3 g，精密称定，置50 ml量瓶中，分别加甲醇、甲酸-甲醇(5∶95)溶液、乙酸乙酯各40 ml，超声提取30 min，放冷，再分别加甲醇、甲酸-甲醇溶液、乙酸乙酯至刻度，摇匀，滤过，取续滤液25 ml，蒸干，残渣加5%碳酸钠溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，弃去乙醚液，用盐酸调水层至PH=2，再用乙醚提取3次，每次20 ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣用流动相溶解并定容至5 ml棕色量瓶中，摇匀，分别作为供试品溶液。

精密吸取上述三种供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定阿魏酸的峰面积，并计算含量，三种溶剂提取的阿魏酸含量基本一致，但通过观察峰中杂质的数量，发现以甲酸-甲醇为溶剂提取的供试品峰的杂质峰数量最少，且分离效果最好，有利于色谱柱的保养维护，故选择甲酸-甲醇(5∶95)为提取溶剂。

2.1.2 萃取次数的选择 取本品研细，取3 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液40 ml，超声提取30 min，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液 25 ml，蒸干，残渣加5%的碳酸钠溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，弃去乙醚液，用盐酸调水层至PH=2，再用乙醚提取4次，每次20 ml，1、2次提取液合并，第3次、第4次分别另置，分别挥干乙醚液，残渣用流动相溶解，1、2次转移并定容至5 ml棕色量瓶中，第3、4次分别转移并定容至2 ml棕色量瓶中，摇匀，即得。

分别精密吸取上述3种溶液及对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定阿魏酸的峰面积，计算含量，结果表明:萃取3次，才能将阿魏酸萃取完全。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品约10 mg，精密称定，置100 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 ml溶液含阿魏酸10 μg)。

2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品约3 g，研细，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲酸-甲醇(5∶95)溶液40 ml，超声提取30 min，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液25 ml，蒸干，残渣加5%的碳酸钠溶液20 ml溶解，用乙醚萃取3次，每次20 ml，弃去乙醚液，用盐酸调水层至 PH=2，再用乙醚提取3次，每次20 ml，合并乙醚提取液，挥干，残渣用流动相溶解并定容至5 ml棕色量瓶中，摇匀，即得。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪中测定。

2.3 专属性实验 取缺当归、川芎的其余药材，按照处方量和制备工艺制成阴性颗粒，并按上述供试品制备方法制成阴性对照液，分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪中测定，结果阴性无干扰。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取阿魏酸对照品溶液(浓度为 10.2 μg/ml)2，6，10，14，18 μl，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，阿魏酸进样量(x)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线Y=49531.9x+36973.2r=0.9997。表明阿魏酸在20.4～183.6ng之间，峰面积与其含量呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液10 μl，重复进样5次，按上述色谱条件测定各峰面积，结果阿魏酸的平均峰面积为537791，RSD为0.89%，表明仪器精密度良好。

2.6 重现性试验 精密称取同一批号的样品(20101028)共5份，依照供试品溶液制备方法进行制备，按上述色谱条件测定并计算含量，5份样品中阿魏酸的含量平均为0.314 mg/袋，RSD为1.79%，说明该方法重现性良好。

2.7 稳定性试验 取与重现性试验同一供试品溶液，在8 h内每隔2小时分别进样10 μL，并测定峰面积，结果RSD为1.82%，表明样品溶液在8 h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验 取同一批号的样品5份，各约1.5 g，精密称定，于每份中加入5 ml的上述阿魏酸对照品溶液(10.2 mg/ml)，依法提取，进样10 μl，计算回收率，得平均回收率为98.65%，RSD为1.00%，说明回收良好。

3 讨论

3.1 色谱条件的确定 对于阿魏酸的检测波长，《中国药典》[5]一部中采用的为316 nm，本实验将阿魏酸用甲醇配制每1 ml含10.2 μg的溶液，以流动相为空白，置紫外可见分光光度计中，从200～400 nm扫描，结果阿魏酸在313 nm波长处有最大吸收峰，流动相在313 nm附近无吸收。故本实验检测波长选择313 nm。流动相的选择参考文献[6-8]，对不同比例的乙腈-0.085%磷酸溶液、甲醇-1%冰醋酸水溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-1%冰醋酸水溶液进行了测试，用乙腈-0.085%磷酸溶液必须在35℃下测定时阿魏酸分离效果好，而改进后用乙腈-水(用H3PO4调PH至2.5)在常温下测定时阿魏酸分离效果就很好，所以选其作为本品的流动相。

3.2 在对提取方法的选择时，曾采用冷浸过夜、超声30 min、回流1 h三种不同的提取方法进行比较，结果冷浸过夜提取不完全;回流提取杂质干扰大;超声30 min提取最为理想，其色谱峰符合要求。

3.3 采用流动相作样品的稀释剂，可避免因流动相与样品稀释剂的不同，使样品中某些成分在流动相中析出而导致堵塞管路的可能性。同时，阿魏酸不稳定，见光易分解，应放在棕色容量瓶中避光保存，且须当天配制当天测定。

[1]卫生部药品标准.WS3-B-3921-98.

[2]胡益勇，徐晓玉.阿魏酸的化学和药理研究进展.中成药，2006，28(2):253-255.

[3]都述虎，金继曙.脑复清胶囊中阿魏酸的含量测定研究.中国现代应用药学，2001，18(1):59-60.

[4]李喜凤，邱天宝，胡亚楠，等.高效毛细管电泳法测定蒲公英中阿魏酸的含量.中国实验方剂学杂志，2010，16(16):27-29.

[5]国家药典委员会编.中华人民共和国药典:2010年版(一部)，2010:124.

[6]刘义梅.HPLC法测定复方银杏口服液中阿魏酸的含量.中药材，2005，28(2):147-148.

[7]董文桑，瞿发林.HPLC法测定镇痛宁胶囊中阿魏酸含量.中国药师，2009，12(3):359-360.

[8]方宝霞，李鹏，时晓亚，陈富超.高效液相色谱法测定生化膏中阿魏酸含量.药物鉴定，2010，19(13):30-31.