罗格列酮对人结肠癌细胞HT-29生长的影响

陈艳华

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，目前主要的治疗方法是手术和化疗。但是对于晚期结肠癌，无法手术，化疗疗效欠佳，寻求高效、低毒的化疗药物迫在眉睫。罗格列酮（Rosiglitazone，ROZ）为过氧化物酶体增殖因子活化受体（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）的合成配体，是一类新的抗糖尿病药物。近年研究表明，ROZ可以通过诱导多种肿瘤细胞分化、凋亡来抑制肿瘤细胞生长，如乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌[1-3]。本实验旨在探讨ROZ对人结肠癌细胞HT-29生长抑制和诱导凋亡作用。

1 试剂与方法

1.1 药品与试剂 ROZ由浙江万马公司提供。用DMSO配成5mmol/l抽滤灭菌后-20℃贮存备用。5氟尿嘧啶购自浙江海门制药厂，用PBS配成1g/L，-20℃贮存备用。MTT（四氮甲基四唑蓝）均为Sigma产品。小牛血清为杭州四季青产品。RPMI-1640购自GIBCOBRL公司。

1.2 细胞与细胞培养 人结肠癌细胞HT-29由中国典型培养物中心引进，用10％小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃，5％CO2温箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

1.3 MTT法检测ROZ对肿瘤细胞增殖的影响 取对数生长期细胞制成4×105/ml单个细胞的细胞的悬液接种于96孔培养板中，每孔100μl，含细胞数4×104/ml，置入37℃，5％CO2培养箱中培养2h，给药组每孔加入100ul药液。调零组和对照组加入相同体积PBS，每组设3个平行孔。培养72h后每孔加入用PBS配制的MTT（5μg/L）20μl（调零组除外），再培养4h，弃去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μl/孔。待甲瓒完全溶解后用EXL-800UV全自动酶联免疫仪在波长570nm处调零后读取吸光度A值。取3孔的均数，按公式细胞生长抑制率（IR）=（1-试验孔A值/对照孔A均值）×100％，计算IR值，以上实验重复4次。

表1 MTT比色法测定ROZ对HT-29细胞增殖活性的作用（SD，n＝4，72h）

表2 流式细胞仪检测ROZ对HT-29细胞凋亡的影响±s n=3）

表2 流式细胞仪检测ROZ对HT-29细胞凋亡的影响±s n=3）

注：*与对照组比较P＜0.05，#与25μmol/LROZ组比较，P＜0.05，△与12.0μg/mL5-FU比较P＜0.05

分组 药物浓度（μmol/L） 凋亡率（％）空白对照组 0 1.82±0.26 5-FU 12.0μg/mL 31.06±0.99* ROZ组 25 8.36±0.21* 50 21.2±0.69*# 100 41.6±1.56*#△

2 结果

2.1 MTT比色法测定ROZ、5-Fu对HT-29细胞增殖活性的影响用0.6、5.0、25.0、50.0、100.0μmol/LROZ处理细胞72h，其对HT-29细胞的抑制率分别是5.25％，8.69％，12.98％，31.02％，55.68％，呈药物浓度依赖方式，但ROZ 50μmol/L及以下浓度时，HT-29细胞增殖和相对抑制率小于20％，提示此浓度范围的ROZ无细胞毒性。当用12.0μg/ml氟尿嘧啶处理细胞72h，其对HT-29细胞的抑制率56.58％。ROZ对HT-29细胞增殖抑制的IC50为136.1μmol/L；表明ROZ具有抑制HT-29细胞作用。100μmol/LROZ与阳性药物12.0μg/ml氟尿嘧啶比较抑制作用接近（见表1）。

2.2 ROZ、5-Fu对HT-29细胞凋亡的影响

ROZ对细胞凋亡的影响，流式细胞术显示HT-29细胞的自然凋亡率为（1.82±0.26）％，25.0μmol/L的ROZ与细胞作用72h后，细胞凋亡率为（8.36±0.21）％，提示25.0μmol/L的ROZ并不诱导细胞凋亡。50，100μmol/L的ROZ作用HT-29细胞凋亡率增加至21.2％，41.6％，与空白对照组相比，差异有统计学意义，其凋亡率均有增加（见表2）。

3 讨论

PPARs是一组具有复杂功能的核受体超家族成员。PPARs与脂肪形成、糖代谢、炎症及肿瘤发生等多种生物过程有关。ROZ为一种噻唑烷二酮类药物，是PPARγ的人工合成配体。近年来研究发现[4-5]，PPARγ在多种肿瘤细胞如乳腺癌，前列腺癌，肺癌，急性白血病等表达，噻唑烷二酮类药物处理上述细胞，可通过诱导分化和（或）凋亡来抑制肿瘤细胞生长。

ROZ人体血药峰值浓度为1.67μmol/L。本实验MTT及用流式细胞术结果显示，低浓度（0.6、5.0、25.0μmol/L）ROZ对HT-29细胞增殖和相对抑制率小于20％，提示此浓度范围的ROZ无细胞毒性。50、100μmol/L ROZ体外可抑制HT-29细胞生长，本实验流式细胞术100μmol/L的ROZ作用HT-29细胞凋亡率增加至41.6％，诱导HT-29细胞凋亡。提示ROZ能抑制HT-29细胞生长，诱导细胞凋亡的浓度较高，单用ROZ体内血药浓度难以达到抗肿瘤作用，可能需要通过与化疗药物合用降低化疗药物剂量，从而减少化疗药物的副作用、减少耐药性而达到抗肿瘤作用。这为研发化疗增敏药物提供很好的实验依据。

[1]Liu H,Zang C,Fenner MH,et al.PPARgamma ligands and ATRA inhibit the invasion of human breast cancer cells in vitro[J].B reast Cancer Res Treat,2003,79（1）：63-74.

[2]Xu Y,Iyengar S,Roberts RL,et al.Primary culture model of peroxisome proliferator-activated receptor gamma activity in prostate cancer cells[J].J Cell Physiol,2003,196（1）：131-143.

[3]Tsubouchi Y,Sano H,Kawahito Y,et al.Inhibition of human lung cancer cell growth by the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists through induction of apoptosis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000,270（2）：400-405.

[4]Chang TH,Szabo E.Induction of differentiation and apoptosis by ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res,2000,60（4）：1129-1138.

[5]戴文香,王莉,陈艳华,等.罗格列酮抗人HL-60细胞增生作用及其作用机制[J].医学研究杂志,2009,38（6）：20-24,136.