烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成相关酶有助于1,4-丁二醇转化为4-羟基丁酸

张鑫，陈国强

清华大学生命科学学院，北京 100084

4-羟基丁酸 (4-hydroxybutyrate，4HB) 作为神经递质是 γ-氨基丁酸的代谢物，以很低的含量存在于哺乳动物大脑中，在医学、药学领域里被认为是一种神经递质，对于自我平衡调整和产生有规律的睡眠等方面起着非常重要的作用[1]。4-羟基丁酸可经氧化转变为琥珀酸半醛、琥珀酸，最终进入三羧酸循环而被代谢降解[2-3]。琥珀酸半醛脱氢酶缺陷的患者会在体液中积累很高浓度的 4-羟基丁酸，并表现出迟钝、癫痫等症状[4]。4-羟基丁酸具有与盐酸氯胺酮类似的麻醉效果，且能刺激体内荷尔蒙素的分泌，因而被归为管制药品[5-6]。

4-羟基丁酸的另一常见用途是作为生物塑料聚3-羟基丁酸酯 4-羟基丁酸酯 (P3HB4HB) 的合成前体，它在共聚物中的比例直接影响着最终P3HB4HB的材料学性质和降解性[7-11]。尽管 4-羟基丁酸可在厌氧菌克氏梭菌Clostridium kluyveri对乙醇、乙酸发酵过程中产生[12]，也存在于古细菌勤奋金属球菌Metallosphaera sedula等的 3-羟基丁酸/4-羟基丁酸固碳途径中[13]，却不能在罗氏真养菌 Ralstonia eutropha、大肠杆菌Escherichia coli等常用的PHA合成菌中形成。因此需要添加结构相关碳源，如 4-羟基丁酸、γ-丁内酯或者1,4-丁二醇作为4-羟基丁酸的来源[14-17]，这些添加物主要以石化产品为原料经化学转化制备[18-20]。

张磊等利用来源于恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida KT2442的醇脱氢酶 (DhaT) 和醛脱氢酶(AldD) 催化完成 1,4-丁二醇向 4-羟基丁酸的转化[21]。这里DhaT和AldD的催化作用需要辅酶因子NAD的参与 (图1)。

对辅酶因子的调节是代谢工程改造中的一个重要手段，提高胞内NADH水平已成功用于促进合成还原性产物如1,3-丙二醇[22]、琥珀酸[23]、丁醇[24]等。同理，提高胞内NAD含量可能促进1,4-丁二醇向4-羟基丁酸的转化。烟酸磷酸核糖转移酶 (Nicotinic Acid Phosphoribosyltransferase，PncB) 和NAD合成酶 (NAD Synthetase，NadE) 是大肠杆菌NAD合成途径的两个关键酶，单独表达时均使胞内NAD (H)总量提高约 2.5倍，共表达时能够提高近 7倍，且NAD增加量要多于 NADH增量[25]。因此，本研究通过在 E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 中共表达pncB-nadE基因，提高1,4-丁二醇向4-羟基丁酸的转化效率。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与引物

菌种Escherichia coli S17-1为清华大学微生物实验室保存。质粒 pZL-dhaT-aldD由本实验室前期构建[21]。本文所用菌种、质粒及引物序列见表1。

fastpfu DNA聚合酶以及用于基因克隆的E. coli DH5α为北京全式金生物技术有限公司产品。各种限制性内切酶为Fermentas产品。质粒提取、胶回收试剂盒为博迈德公司产品。

1.2 培养基及培养条件

质粒构建过程以及摇瓶种子液均采用 LB培养基。摇瓶发酵培养基为另外添加了10 g/L 1,4-丁二醇的 LB培养基。根据重组菌携带质粒的抗性向灭菌冷却后的培养基中加入抗生素，其中氨苄青霉素浓度为100 mg/L，卡那霉素浓度为50 mg/L。

培养条件为37 ℃，200 r/min。除摇瓶发酵培养时间为48 h外，其余情况均培养12 h。

图1 1,4-丁二醇向4-羟基丁酸的转化反应Fig. 1 Conversion of 1,4-BD to 4HB.

表1 本研究中所使用的菌种、质粒和引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

1.3 NAD (H) 含量测定

按照已报道方法提取胞内NAD和NADH[22]，略有修改。将3 mL摇瓶发酵菌液于4 ℃离心收集细胞，弃上清。将细胞用冰冷的去离子水洗涤2次后充分重悬于0.2 mL去离子水中。加入50 μL 0.4 mol/L HCl (提取NAD) 或者0.4 mol/L KOH (提取NADH)，充分混匀后在冰上放置10 min。NAD提取液在50 ℃水浴，NADH提取液在30 ℃水浴。10 min后迅速移到冰上加入50 μL 0.4 mol/L KOH (提取NAD) 或者0.4 mol/L HCl (提取NADH) 进行中和。4 ℃、12 000 r/min离心10 min。上清液即为NAD (H) 的提取液，将其移至新的离心管中，立即检测。

含量测定采用酶循环法，反应体系为 (1 mL)：450 μL HEPES 缓冲液 (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，0.15 mol/L，pH 7.4)；200 μL 5-乙基吩嗪硫酸盐 (PES，4 mg/mL)；200 μL噻唑蓝 (MTT，5 g/L)；50 μL乙醇；50 μL的600 U/mL乙醇脱氢酶 (ADH)。上述反应液混匀后37 ℃温育5 min，加入50 μL的NAD (H) 的提取液起始反应。测定5 min内OD570的变化。吸光度-时间曲线的斜率反应出提取液中NAD (H) 的浓度。

1.4 分析方法

1.4.1 细胞干重的测定

培养结束后，12 000 r/min、10 min离心收集菌体，然后用去离子水洗涤、离心，去掉菌体表面粘附的培养基成分。将得到的细胞在抽真空条件下冰冻干燥至恒重，测定细胞干重 (Dry cell weight，DCW)。

1.4.2 产物浓度的测定

4-羟基丁酸的分析方法参考文献[21]，取菌液离心后上清进行冰干、酯化和气相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 pncB/nadE基因表达质粒的构建

以E. coli MG1655基因组DNA为模板，表1中相应引物用 fastpfu DNA聚合酶对基因 pncB和nadE进行PCR扩增。反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，58 ℃复性20 s，72 ℃延伸45/30 s，30个循环；最后72 ℃延伸8 min。

将pncB/nadE基因的PCR回收片段和表达载体pEn分别进行 Sac Ⅰ/Xba Ⅰ酶切，连接后化学法转入E. coli DH5α感受态中，阳性克隆经EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切，得到目的基因表达单元和载体骨架两条带 (图2)，证明质粒pEnpncB和pEnnadE构建成功。再用Avr Ⅱ/Xho Ⅰ酶切pEnnadE，回收nadE表达单元一段，将其插入经Nhe Ⅰ/Xho Ⅰ酶切的pEnpncB中，因为Avr Ⅱ和Nhe Ⅰ是同尾酶，因此两片段可相连得到质粒pEnpncBnadE。经Xba Ⅰ酶切验证正确后与质粒 pZL-dhaT-aldD一起经电击法转入E. coli S17-1感受态，获得重组菌株。已有报道，基于 pBBR1MCS2所构建的质粒能够与pMD19-T Simple的衍生质粒共存[26]，因此，这里的pZL-dhaT-aldD和 pEnpncBnadE能够协同作用。进一步质粒提取证实了两质粒的相容性。

2.2 重组菌摇瓶发酵结果

以E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 为参照，验证PncB-NadE表达对1,4-丁二醇转化的影响 (表2)。

野生型大肠杆菌也能由 1,4-丁二醇合成少量4-羟基丁酸，却不能进一步代谢利用 4-羟基丁酸[16,21,27]。另外，基因dhaT和 (或) aldD在嗜水气假单胞菌 Aeromonas hydrophila 4AK4与 E. coli S17-1中显示出相似的作用效果，而 A. hydrophila 4AK4 (pZL-dhaT-aldD) 的55 h发酵结果显示4-羟基丁酸积累量不断上升[21]。可推断E. coli S17-1重组菌的 4-羟基丁酸积累量以及 1,4-丁二醇的消耗量在发酵过程中应是逐渐增大的，因此，这里以48 h发酵后的结果作为讨论依据。

对照组E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 由10 g/L的 1,4-丁二醇合成 4.31 g/L 4-羟基丁酸，转化率(mol/mol%) 为36.44%。而同条件下，E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD，pEnpncBnadE) 则得到4.87 g/L 4-羟基丁酸，1,4-丁二醇的转化率为 41.18%，比对照组提高13.03%。计算单位细胞量的4-羟基丁酸产率能够更直接说明PncB-NadE的作用。对照组单位细胞产率为1.32 g/g，实验组相应值为1.86 g/g。综上结果，PncB-NadE的共表达明显促进4-羟基丁酸的合成。

尽管如此，仍有近60%的1,4-丁二醇未被利用，这是因为醇脱氢酶 (DhaT) 对1,4-丁二醇活性不高，且发酵后期会进一步减弱[21]，所以，需要筛选出更有效的酶来催化反应以充分利用1,4-丁二醇。

此外，PncB-NadE的表达同时导致细胞干重下降。可能是因为胞内NAD的增加导致氧化还原态失衡，影响了细胞的正常代谢。细胞总量减少是转化率不能充分提高的另一原因，可通过添加葡萄糖等有利碳源来刺激细胞生长，进而增加 1,4-丁二醇利用率。

图2 质粒pEnpncB、pEnnadE、pEnpncBnadE的酶切图谱Fig. 2 Characterization of pEnpncB, pEnnadE, pEnpncBnadE. M: 1 kb DNA marker; p: pEnpncB digested with EcoR I/Xho I, two brands were 1 532 bp and 2 706 bp; n: pEnnadE digested with EcoR I/Xho I, two brands were 1 173 bp and 2 706 bp; pn: pEnpncBnadE digested with Xba I, two brands were 1 155 bp and 4 238 bp.

表2 重组菌摇瓶发酵生产4-羟基丁酸Table 2 Production of 4-hydroxybutyric acid by E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE) and E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)

2.3 NAD (H) 含量测定

酶循环反应中吸光度-时间曲线的斜率正比于提取液中 NAD (H) 的浓度。结果证明 PncB-NadE的表达确实能提高胞内NAD (H) 浓度 (图3)。结合表2计算单位质量细胞内NAD和NADH含量变化，E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD，pEnpncBnadE) 比E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 中NAD和NADH含量分别提高2.04倍和2.74倍。

图3 重组菌NAD (H) 含量测定Fig. 3 Relative concentration of NAD (H) in different recombinants. 1: NAD (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE)); 2: NAD (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)); 3: NADH (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE)); 4: NADH (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)).

3 结论

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本次计算中取泊松比为υ=0.35，Ib=0.7，rm=12.5。室内试验测得的主固结完成后的剪切模量为G=0.664 MPa。

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