生物降解微球制剂的体内外相关性研究进展

李静，苏庆，赵刚

可生物降解注射用微球是近年来发展较快的一种新剂型，它是指利用天然或合成的高分子材料，将固体或液体药物包嵌成直径为1～250 µm 的微小球体。该制剂技术将蛋白和多肽等类药物制备成以微球为载体的长效缓控释制剂。通过皮下或肌肉给药，使药物在一定时间内缓慢释放出来，在体内长期维持有效的血药浓度，显著减少给药次数，提高患者的顺应性，实现安全、有效、方便给药。微球制剂的体外释药特性主要是研究微球体外释药动力学过程；而缓控释微球在体内所形成的药物动力学过程是评价微球控释效果的终极目标。体内外相关性（in vitro—in vivo correlation，IVIVC）是用数学模型描述药物体外释放特性（药物溶出的速率或程度）与体内药动学过程（血药浓度或药物吸收量）的关系。制剂 IVIVC 模型是用已知药物体外释放特征，预测药物体内的药时曲线。建立 IVIVC 的目的是通过体外实验，预测药物在体内的作用特征，可指导和优化处方的设计，确立更具代表性的释放度测定实验方法，为质量标准的制订提供依据；同时还可减免生物等效性研究[1-2]。本文就近年来微球制剂的体外释放度评价及体内外相关性的研究进展进行综述。

1 微球制剂的体外释放度评价

体外释放度试验是指微球制剂在特定条件下释药速率的体外评价方法。适宜的体外释放度试验方法能够较好地反映微球在体内的释药状况，有利于筛选出更理想的处方及工艺。

1.1 体外释放度实验方法

目前药典上还没有收载专用于微球体外释放度测定的方法，研究者一般采用自行设计的方法，使体外释放条件尽可能地模拟体内。测定温度一般为37℃，测定介质的体积通常远小于常规的溶出度测定法，可以只有几十毫升乃至几毫升，但必须满足漏槽状态[3]。

1.1.1 摇床法 亦称培养法或提取法，将一定量的微球直接置入一定体积的介质中，在一定频率下振荡，定时取样，在取样的同时补充相应的新鲜介质或在测试后再将取出的介质放回去[4-5]。该法的主要缺点是取样过程中很难避免微球的损失。此外，随着聚合物酸性降解产物的形成和积累，介质的 pH 值可能会持续降低。

Han 等[6]采用 W/O/W 复乳溶剂挥发法制备载平阳霉素 PLGA 微球，摇床法测定释放度，介质 37℃、25 ml、转速 75 r/m，10、20、28 d 的累积释放量分别为45%、80%、100%；以 Beagle 犬为实验动物，测定体内 10 d 的累积释放量为60%，而 20 d 的累积释放量为97%以上，体内释放速率显著快于体外。

1.1.2 动态透析法 透析法是将药物微球放入透析袋，置于相应介质中进行测试。振荡的频率可以是 50、75 r/min和 1 周振摇数次等。这是目前应用较多的一种测定方法[7]。该方法有利于透析膜外介质的交换，可避免样品处理过程中微球的损失和释放介质 pH 的改变。

1.1.3 药典的溶出度测定法 包括桨法[8]、转篮法和流通池法（flow-though cell）。2000 版《美国药典》（USP）和 1998版《英国药典》（BP）在控释制剂释放度检查项下均收载流通池法，该方法的实验条件近似生理状态，方法简便、重现性好，比较适合于微球制剂的体外释放度评价，但该仪器普及率不高，实际研究工作中多采用摇床法或动态透析法。Majithiya 和 Murthy[9]采用《美国药典》溶出度测试仪的桨法测定了克拉霉素壳聚糖微球在 pH 1.2 的模拟胃液中的释放度。

1.2 体外加速释放试验

药物从生物降解微球注射剂内释药往往需要数天、几个月甚至 1年以上的时间，采用模拟体内条件按“实时”方法考察药物的释药速率，在生产上显然是行不通的，所以研究一种有良好相关性的体外释放加速试验方法，对快速检测微球的质量有十分重要的意义[10]。

1.2.1 释放介质 释放介质的组成、pH 值、离子强度、渗透压、表面活性剂种类及浓度、介质温度及酯酶等对释放速率都可能有显著影响。

长效注射微球一般采用肌注或皮下注射，而组织环境的pH 为7 左右，故常采用的介质是 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液。Zolnik 和 Burgess[11]研究了降低介质 pH 对地塞米松微球释放的影响。结果表明，释放初期酸性和中性介质区别不大，微球具有相同的突释量，停滞释放相也相当。但随着聚合物的进一步降解，低 pH 条件逐步加快了聚酯微球的释药速率。最终，实时释放需要 30 d 的微球，在酸性介质中 19 d 便可释放完全。

1.2.2 释放温度 冼远芳等[12]考察了不同载药量的阿司匹林聚乳酸微球在不同温度下的体外释药行为，采用动态透析法，参考聚乳酸的玻璃化转变温度，Tg=（53±1.0）℃，选择释放介质磷酸盐缓冲溶液的温度分别为42、47、55、58℃，结果表明，一级释药方程能比较好地描述阿司匹林聚乳酸微球的释药特征。阿司匹林聚乳酸微球在 37℃长期释放累计百分数（y%）与不同温度（42，47、55、58℃）下加速释放的累积释放百分数（Y%）的相关性，采用ln(100-Y) 对 ln(100-y) 线性拟合，结果表明，两种不同载药微球的长期释放与在 55℃时加速释放有良好的相关性（RA= 0.99547，RA= 0.99338）。在高于聚乳酸 Tg约 2～3℃的 pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，进行体外释放可以作为快速考察聚乳酸微球长期释放行为的有效方法。

1.2.3 其他因素 Mesens 等[13]建立了利培酮微球体外加速释放的方法，他们在释放介质中按质量比加入 27.5%的乙醇，获得了较好的加速效果。Faisant 等[14]研究了放射吸收量对 5-氟尿嘧啶-PLGA 微球释药的影响，结果表明，药物释放速度随着放射性吸收量的增加而加快。

2 微球制剂的体内外释放相关性评价

按照《中国药典》（2010 版）二部中“缓控释制剂指导原则”只有当体内外具有相关性，才能通过体外释放曲线预测体内的情况。体内外的相关程度的高低与体外释放度测定方法和体内药动学测定方法有关，也与结果的数学处理和统计分析方法有关。对微球体内释药行为的评价现主要采用两种方法[15]：①给药部位微球残余药量评价；②血药浓度测定。

2.1 体内外相关性评价的方法

体内外相关性可分为三级水平：①体外释放曲线与体内释放曲线上对应的各个时间点分别相关，即点对点相关，表明两条曲线可以重合；②应用统计矩分析原理建立体外释放的平均时间与体内平均滞留时间之间相关；③将一个释放时间点（t50%，t90%等）与一个药动学参数（如AUC，Cmax或tmax）之间单点相关。

Zolink 和 Burgess[16]采用流通池法测定载地塞米松PLGA 微球体外释放度，体外释放特性呈显著三相特征即突释相、时滞相和次零级释放相（secondary zero-order）。而体内释放特性与体外释放有所不同，体内无时滞相，其释放速率特性呈表观零级（apparent zero-order）释放，且释放速率比体外释放快，产生这种现象的原因与体内酶的作用、组织间隙液容量及其微球周围微环境的 pH 有关。将 PLGAMw13000 载地塞米松微球各相应时间点体外累积释放量对体内累积释放量作线性回归，两者相关性显著：体内累积释放量（%）= 1.6381×体外累积释放量（%）－ 24.457，R =0.9862。实验证明：该方程可较准确地的描述体内外释药行为的相关性。

2.2 体内吸收数据的计算方法

2.2.1 室模型依赖法 点对点相关水平的分析中，体内吸收数据的计算采用依赖室模型的计算方法（如 wangernelson 法、loo-Rigelman 法）。室模型的计算方法简单，融入了较多的实验数据，数据的点对点对应能较完整地反映微球中药物的体外释放和体内吸收之间的相关关系。王津等[17]对布洛芬缓释微球的大鼠体内血药浓度-时间数据进行房室模型拟合，结果显示用单室开放模型拟合较好，以体外累积释放度（X）为横坐标、体内吸收百分率（F）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 F = 1.5481X + 5.1587，r = 0.9887，表明体外释放度与体内吸收百分率相关性显著。

2.2.2 逆卷积分法 美国 FDA 选用逆卷积分法计算体内吸收（溶出）数据，该法不需要对体内血药浓度一时间数据与体外释放数据进行模型拟合，直接得到体内药物的吸收动态变化，同时还可以通过体外释放数据预测体内血药浓度。逆卷积分法不依赖室模型的拟合，对于模型化困难的药物尤其适合，适用于各种体内外数据的相关性研究。梅康康等[18]应用逆卷积分法计算非诺贝特缓释微球片的体内外相关性，结果表明非诺贝特缓释微球片的体外释放与体内吸收相关性良好。

2.2.3 统计矩法 采用普通的药动学参数AUC、Cmax或Tmax作为体内参数与体外释放数据进行相关性分析，这是一种部分相关，所得的相关参数不能反映血药浓度-时间曲线形状。统计矩分析法不受模型的限制，无需假设药物在系统中的转运动力学，把药时曲线看作某种概率统计曲线，运用了所有的体内外数据进行计算，体内参数可采用平均体内药物滞留时间（MRT）、平均药物吸收时间（MAT）或平均体内释药时间（MDT），体外参数采用体外平均释放时间（MDT in vitro），通过比较体内外参数建立起较高水平的相关性。Guerrero 等[19]研究聚（D，L-丙交酯）-聚（D，L-乳酸，羟基乙酸）共聚物酮替芬微球的体内外相关性，通过比较体外平均释放时间和体内药物滞留时间，建立二级体内外相关性水平。

Monti 等[20]分别采用泊洛沙姆（Poloxamer 407）及其与月桂酸聚乙二醇甘油酯（Gelucire® 50/13）的混合物制备载阿替洛尔经口腔黏膜给药的微球制剂。用透过醋酸纤维素膜法和 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液进行体外释放度试验。释放时程为480min，Poloxamer 407 及其与 Gelucire® 50/13的混合物制备的微球累积释放量分别为（25.05±3.86）%和（44.44±4.20）%；以家兔为实验动物进行生物利用度评价，统计矩分析法计算药动学参数，其绝对生物利用度分别为29.38%和 33.07%，而等剂量的上市口服制剂为17.42%，口腔黏膜给药的阿替洛尔微球制剂可显著提高生物利用度。

3 小结

尽管体内外释药速度可以保持较好的相关性，但从已有的研究不难看出，药物在体内的释放速率常常快于体外。通过体外释放度试验条件的选择可以获得良好的体内外相关性。采用透析法以 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液为介质是目前用的较多的方法。体内各种免疫反应以及降解产物所导致的微酸性环境等因素导致了体内释放速度快于体外。

注射微球体外释放度测定周期长，因此，非常有必要建立体外释放度的加速试验方法用于快速的筛选处方和工艺参数，经实验研究可建立起加速试验方法来快速考察长效生物降解微球的体外释放度。

采用逆卷积分法计算体内吸收数据，与相应时间点的体外累积释放百分数作线性回归，考察制剂的体内外相关性，不受隔室模型拟合的制约，适用范围广、准确性好；目前该方法为进行体内外相关性研究的较好方法。

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