靶向Tak1基因的siRNA干扰对小鼠腹腔巨噬细胞的生物学效应

王钦富，李坤，李志，徐娜，董敏，韩慧

转化生长因子 β 激活激酶（transforming growth factor-β-activating kinase 1，Tak1）为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在功能与序列上与丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen—activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）相关，属于 MAPKKKs 家族成员。众多研究表明 Tak1 介导的信号转导通路参与了炎症（如脓毒症）、免疫反应、细胞凋亡和纤维化疾病等病理生理过程以及细胞周期调控与细胞分化等过程，因而 Tak1 参与调控的信号通路与人类疾病的关系日益受到普遍关注。Tak1 基因在 T、B 免疫细胞中起到非常重要的作用，但在髓样细胞中的作用尚未见报道。本文利用 siRNA 技术使小鼠腹腔巨噬细胞 Tak1 基因沉默并观察其生物学效应，初步探讨 Tak1 基因在髓样细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明纯种小鼠（No：SCXK2002-0002），II 级，体重 18～22 g，购自大连医科大学动物中心。靶向Tak1 基因的 siRNA（正义链 5’ GCUCAUGCCAU GAGCUGGUGUUUAC 3’，反义链 5’ GUAAACAC CAGCUCAUGGCAUGAGC 3’，MSS218539）、Trizol总 RNA 抽提试剂、逆转录试剂盒 Super Strip III为美国Invitrogen 公司产品；IL-1β ELISA检测试剂盒为美国 R&D 公司产品；NucleofectorTM试剂为德国 Amaxa 公司产品。巨噬细胞培养液：DMEM 培养液，加 10%胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺（使终浓度为2mmol/L）。无水乙醇、氯仿、异丙醇均为国产分析纯；焦碳酸二乙酯（DEPC）为美国 Sigma 公司产品。Prism 7700 PCR仪为美国 ABI 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞培养 取昆明纯种小鼠，腹腔注射 4%巯基乙醇酸钠（thioglycolate）1～2 ml，3～5 d 后行麻醉、脱颈致死，用巨噬细胞培养液灌洗腹腔，吸出培养液，放入无菌平皿铺板 3～5 h，吸弃上清，用培养液洗涤 1 次，备用。

1.2.2 siRNA 基因沉默的最佳转染浓度和时间的优化 备用小鼠腹腔巨噬细胞 100 g，洗涤 5min，取 1.5×106个巨噬细胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分别加入 0.6、1.2、1.6 μmol/L Tak1 siRNA，混匀，并设立空白对照。移入电转杯（勿产生气泡），放置电转仪，实施转染。然后移入预温的培养板中培养，24 h 后收集细胞，Trizol reagent 法提取总RNA，进行荧光定量 PCR，检测 Tak1 mRNA 表达。Tak1 引物序列：正义链 5’ ATTCCACAGATAC CAATGGCTC 3’；反义链 5’ TGTAGTAACAATGC GATTTCGG 3’。RNA 浓度和纯度检测，按常规方法操作。按照 Super Strip III 试剂盒说明书进行RT-PCR，同时设计出内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物（序列：正义链 5’ AGGGCATCT TGGGCTACAC 3’；反义链 5’ TGGTCCAGGGTTT CTTACTCC 3’），在检测 Tak1 基因 mRNA 的同时对每个样品中 GAPDH 的表达进行检测，以校正不同样品之间因 RNA 总量、质量及逆转录反应效率差异所导致的目的基因的表达差异。取 5 μl cDNA进行荧光定量 PCR。循环条件：94℃预变性 3min，94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，共进行 40 个循环。

1.2.3 Western blotting 技术检测蛋白表达 小鼠腹腔巨噬细胞 100 g，洗涤 5min，取 1.5×106个巨噬细胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分别加入0.6、1.2、1.6 μmol Tak1 siRNA，并设立空白对照，转染后接种 24 孔板，密度 6×105个/ml，每孔500 μl。siRNA 转染后 48 h 进行细胞总蛋白提取，BCA 法进行蛋白质定量。各组样本均取总蛋白质15 μg 上样，经 100 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)后转 PVDF 膜。与兔抗小鼠 Tak1多克隆一抗 4℃孵育过夜。与 HRP 标记的羊抗兔 IgG 抗体室温孵育 1 h 后，ECL 显色，暗室中观察，胶片曝光记录结果。同时用 β-actin 作为内参确证蛋白上样量一致。

1.2.4 siRNA 转染对巨噬细胞分泌细胞因子水平的影响 小鼠腹腔巨噬细胞按前述方法加入1.6 μmol Tak1 siRNA，并设立空白对照，转染后接种 48 孔板，密度 6×105个/ml，每孔 250 μl。转染后 24 h 加入 100 ng/ml 脂多糖（LPS），24 h 后收集上清，ELISA 法检测 IL-1β 表达水平。设立3 个平行孔，实验重复三次取平均值。

1.3 统计学处理

用 SPSS 11.0 统计学软件进行分析，多个样本均数间的数据采用单因素方差分析，两样本比较采用配对资料t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA 基因沉默的最佳转染浓度

细胞转染 Tak1 siRNA，设立空白对照，转染24 h 后收集细胞检测 mRNA 水平（图1）。实验结果显示各组抑制率分别为69.73%、80.85%、88.78%。不同浓度 siRNA 与空白对照组比较有统计学差异（P＜0.01）。

图1 小鼠腹腔巨噬细胞转染后 Tak1 mRNA 表达水平Figure 1 Tak1 mRNA level of Tak1 siRNA transfected mouse peritoneal macrophage

2.2 siRNA 转染后 Tak1 基因蛋白的变化

细胞转染 Tak1 siRNA，设立空白对照，转染48 h 收集细胞，用 Western blotting 法检测 Tak1蛋白表达。各浓度 Tak1 siRNA 转染后 48 h Tak1蛋白表达明显减弱。β-actin 各组无差异（图2）。

图2 Tak1 siRNA 下调正常小鼠腹腔巨噬细胞结果Figure 2 Tak1 expression of Tak1 siRNA transfected normal mouse peritoneal macrophage

图3 Tak1 siRNA 转染对巨噬细胞分泌细胞因子 IL-1β水平的影响Figure 3 IL-1β secretion of Tak1 siRNA transfected macrophage

2.3 siRNA转染对巨噬细胞分泌细胞因子水平的影响

小鼠腹腔巨噬细胞转染 Tak1 siRNA，浓度1.6 μmol/L，设立空白对照，转染 24 h加入 LPS，24 h 后收集培养细胞上清进行 IL-1β 表达水平检测（图3）。转染组 IL-1β 表达水平为（248.7±66.3）pg/ml，显著高于对照组（41.1±7.9）pg/ml（P＜0.01）。

3 讨论

Tak1 在天然免疫和获得性免疫中起着关键作用。Sato 等[1]采用 cre-loxp 技术条件性敲除 B 细胞中 Tak1 基因，证实 Tak1 在B细胞 NF-κB 活化及 JNK 活化中不可或缺。随后 Sato 等[2]又构建Tak1 缺失 T 细胞小鼠，证实 Tak1 在 TCR 介导NF-κB 活化及 MAPKs（mitogen-activated protein kinase）活化，以及 T 细胞成熟、增殖中的关键作用。Wan 等[3]也证实 Tak1 在 T 细胞发生、增殖、成熟中的作用， Tak1 缺失 T 细胞小鼠胸腺细胞发育，特别是 Treg 细胞发育减少，NF-κB 活性及JNK 活性降低。Liu 等[4]也报道了类似结果。Tang等[5]利用 Mx1Cre 小鼠和 Tak1fx/fx小鼠交配得到Mx1Cre＋Tak1fx/fx小鼠，诱导产生 Tak1 基因敲除小鼠，研究 Tak1 基因对血细胞生成的影响，结果表现为骨髓和肝损伤，血细胞生成减少，凋亡增加。

本文通过 siRNA 干扰技术，研究沉默 Tak1基因的表达。结果表明 siRNA 可以有效抑制 Tak1 mRNA 及蛋白的表达，抑制率可达到 88.78%。哺乳动物细胞中可能缺少产生持续性 RNA 干扰效应的能力，所以细胞进行 2～4 次分裂后 RNA 干扰效应一般会消失[6]。此外，siRNA 容易被普遍存在的 RNA 酶降解，只能维持较短时间的基因沉默作用。在本研究中 siRNA 转染小鼠腹腔巨噬细胞后，Tak1 基因 mRNA 水平在 48 h 达到抑制，Tak1 基因蛋白实现沉默效应，因此，我们选择在24 h 对小鼠腹腔巨噬细胞受 LPS 刺激细胞因子IL-1β 分泌水平进行检测，结果反映出 Tak1 基因在髓样细胞中呈负性调控作用。我们实验观察到Tak1 基因在髓样细胞被沉默后，并没有抑制 LPS激活TLR 信号通路，炎性细胞因子 IL-1β 反而升高，说明髓样细胞 Tak1 基因调控炎性因子的产生存在复杂机制。

维持和调控机体免疫应答对机体是非常关键的，正常的免疫应答对机体能够抵抗感染，而过度的免疫应答会对机体产生损害。揭示 Tak1 基因在髓样细胞中的不同于 T、B 细胞的作用规律，对深入了解免疫系统的调控网络具有重要的意义，可能为其分子靶点治疗提供新的视角。

[1]Sato S, Sanjo H, Takeda K, et al.Essential function for the kinase Tak1 in innate and adaptive immune responses.Nat Immunol, 2005,6(11):1087-1095.

[2]Sato S, Sanjo H, Tsujimura T, et al.Tak1 is indispensable for development of T cells and prevention of colitis by the generation of regulatory T cells.Int Immunol, 2006, 18(10):1405-1411.

[3]Wan YY, Chi H, Xie M, et al.The kinase Tak1 integrates antigen and cytokine receptor signaling for T cell development, survival and function.Nat Immunol, 2006, 7(8):851-858.

[4]Liu HH, Xie M, Schneider MD, et al.Essential role of TAK1 in thymocyte development and activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2006, 103(31):11677-11682.

[5]Tang M, Wei XD, Guo YS, et al.Tak1 is required for the survival of hematopoietic cells and hepatocytes in mice.J Exp Med, 2008, 205(7):1611-1619.

[6]Stein P, Svoboda P, Anger M, et al.RNAi: mammalian oocytes do it without RNA-dependent RNA polymerase.RNA, 2003, 9(2):187-192.