湘蕾金银花提取物对马铃薯多酚氧化酶活性的影响

罗文娟，曾彪，田仁军，龙桂友，彭国平

马铃薯是一种重要的经济作物，但马铃薯的多酚氧化酶（PPO）催化生成一系列色素物引起的褐变现象一直制约着马铃薯的开发利用[1-3]。金银花（Lonicera japonicaThunb.）中含有绿原酸、异绿原酸、木犀草素等不饱和化合物，其中的酚羟基结构极易与自由基反应，故具有显著的抗氧化特性[4]。本文通过研究不同提取方法的金银花提取物对马铃薯多酚氧化酶活性的影响，探寻马铃薯多酚氧化酶的天然抑制剂，为马铃薯深加工过程中防止褐变提供新的思路和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 湘蕾金银花干品，产自湖南省隆回县小沙江金银花基地，经 50℃干燥 48 h，粉碎至 40 目；马铃薯，市售。

1.1.2 试剂 无水乙醇购自湖南汇虹试剂有限公司，分析纯。

1.1.3 仪器 UV-2100 双光束紫外-可见分光光度为北京瑞利分析仪器有限公司产品；RE-52AA 旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品；高速冷冻离心机 CR21G 为日本日立公司产品。

1.2 方法

1.2.1 湘蕾金银花提取物的制备

1.2.1.1 水提法：精确称取 5.0 g 湘蕾金银花粉末置圆底烧瓶中，加入 50 ml 蒸馏水回流提取 1 h。过滤后，滤渣再用 50 ml 蒸馏水提取 0.5 h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至流膏状。用 10 ml 热蒸馏水洗出，4500×g离心10min，上清液定容至 20 ml，配制成含生药 0.25 g/ml 的湘蕾金银花水提物溶液，备用。

1.2.1.2 醇提法：以 70%乙醇为溶剂按照 1.2.1.1 法回流提取，配制成含生药 0.25 g/ml 的湘蕾金银花醇提物溶液，备用。

1.2.1.3 醇水结合提取法：将湘蕾金银花晒干品粉末 5.0 g用 95%乙醇提取 1 h 后，滤渣再用 50 ml 蒸馏水提取0.5 h，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至流膏状。用 10 ml热蒸馏水洗出，4500×g离心 10min，上清液定容至20 ml，配制成含生药 0.25 g/ml 的湘蕾金银花醇水结合提取物溶液，备用。

1.2.2 马铃薯多酚氧化酶（PPO）的提取 将 4℃下冷藏的马铃薯去皮，取块茎 100 g，加 100 ml 经 4℃预冷的磷酸缓冲液（pH 6.8），用组织匀浆机打成匀浆。4 层纱布过滤，滤液 5600×g高速冷冻离心 10min，取上清液用蒸馏水定容至 50 ml，得马铃薯 PPO 粗酶液，置冰水浴中保存，备用[5]。

1.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性检测 将 pH 6.8 磷酸缓冲液、 0.2 mol/L 邻苯二酚及 PPO 液在 30℃的水浴中预保温，在比色皿中依次加入 2.0 ml 的磷酸缓冲液、0.3 ml 的酶液、0.5 ml 浓度为0.2 mol/L 的邻苯二酚溶液（空白对照为2.5 ml 的磷酸缓冲液、0.3 ml 的酶液），用 UV-2100 双光束紫外可见分光光度计在 410 nm 处比色，每 2 秒计数一次，测得 1min 内的 PPO 酶活动力学特征曲线图。

1.2.4 不同剂量的金银花提取物对 PPO 动力学影响的研究 在 1.2.3 中的反应组和空白对照组中分别加入 0、10、15、20、25、30 μl 金银花的 3 种提取物，按照上述测定方法，每 2 秒计数一次，记录各时刻的 OD 值，将在相同时刻测得两个 OD 值相减，以时间为横轴，OD 差值为纵轴作图，得金银花提取物对 PPO 活性影响的动力学特征曲线。规定一个酶活力单位（U）定义为：在测定条件下，单位时间内引起吸光度改变 0.001 所需的酶量。以最初 10 s内直线段的斜率（△OD/0.001 t）求酶活力。

1.3 统计学处理

用 SPSS13.0 统计软件对实验数据进行分析，以P＜0.05 为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

2 结果

2.1 湘蕾金银花提取物对 PPO 酶促反应动力学的影响

三种湘蕾金银花提取物对 PPO 活性影响的动力学曲线（图1～3）表明：多酚氧化酶氧化邻苯二酚的反应和产物的生成速度初始较快，随着反应时间的延长，PPO 的活性逐渐降低，这是由于生成的醌类物质使多酚氧化酶活性受到抑制的结果，即存在反馈抑制作用。图1 表明反应体系中金银花水提物对 PPO 酶活抑制作用存在剂量效应；图2表明不同剂量的金银花醇提物对 PPO 酶活抑制效果差异不明显；图3 表明金银花醇水结合提取物对 PPO 酶活抑制作用明显，30 μl 醇水结合提取物对酶活抑制作用最强。

图1 湘蕾金银花水提物对 PPO 活性影响的动力学曲线

图2 湘蕾金银花醇提物对 PPO 活性影响的动力学曲线

图3 湘蕾金银花醇水结合提取物对 PPO 活性影响的动力学曲线

2.2 不同提取方法的湘蕾金银花提取物对 PPO 活性影响的比较

SPSS统计分析结果（表1）表明，三种提取物对 PPO活性存在明显抑制作用；三种提取方法获得的提取物对PPO 活性抑制作用差异不显著（P＞ 0.05）；水提取物和醇水混合提取物对 PPO活性抑制作用存在剂量效应（P＜0.01），而醇提物对 PPO 活性抑制作用无剂量效应（P＞0.05）。

表1 不同剂量的湘蕾金银花 3 种提取物对 PPO 酶活抑制作用的影响

3 讨论

本试验研究结果表明：湘蕾金银花水提物、70%乙醇提取物、95%乙醇和水结合提取物对 PPO 活性均存在抑制作用，表明湘蕾金银花含有多种 PPO 抑制成分，抑制强弱表明以水溶物中的 PPO 抑制剂较多，在 70%乙醇提取物中含量相对较少，根据笔者对湘蕾金银花活性成分的提取经验，70%乙醇提取组分多是黄酮类，95%乙醇与水提取的混合组分中成分较复杂，对 PPO 活性具有抑制作用的成分还有待进一步探究。

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