启东肝癌高发区队列样本库的建立与应用

陈建国，王金兵，陆建华，张永辉，陈陶阳

启东是我国的肝癌高发区，自 1972年以来，启东现场采用流行病学、临床及实验室等方法，对肝癌的病因、肝癌的诊断和肝癌的治疗等进行了广泛的研究[1]。通过采集并分析大量血样、尿样及其他标本，为肝癌的实验研究提供了医学和生物学证据。20 世纪 80年代末尝试建立生物标本库，为启东肝癌研究的持续和深入发展增加了竞争力。现把我所生物样本库的建立与应用做一总结。

1 样本的种类及保留方法

1.1 样本种类

1.1.1 血样 ①血清：未抗凝的血标本经离心后获得，即血浆中除去纤维蛋白后的淡黄色胶状液体。20 世纪 80年代用注射器采集外周静脉血 5 ml 注入玻璃试管；90年代逐步采用真空采血管采集外周静脉血 5～10 ml，室温直立静置 30min（现场采血室温放置时间控制在 6 h 以内），室温，1000×g 水平离心 15min。用一次性移液管小心吸取上层血清，根据实验需要的量分装到 1.5 ml 的冻存管后分别保存。②血浆：抗凝的血标本经离心后获得，即血液中除血细胞、血小板之外的部分。抗凝剂可用肝素、EDTA-K3或EDTA-K2等。采用不同规格（6～10 ml）的真空采血管采集外周静脉血，立即轻轻颠倒震摇 8～10 次，室温直立静置 30min（现场采血室温放置时间控制在 6 h 以内）。实验室分离前再次轻轻颠倒混匀 8～10 次，室温水平离心1500×g，20min。用一次性移液管依次小心吸取上层血浆，根据实验需要量分装到 1.5 ml 的冻存管。③白细胞：全血中的一种细胞成分。抗凝采血管离心分离后，上层为血浆、中间层即为白细胞（WBC）（下层为红细胞）。–80℃保存。

1.1.2 尿样 分为晨尿、夜尿或 24 h 尿样，根据项目设计和需要，选用不同规格的采样容器分别采集尿液，并记录总量，做常规检测及（或）特殊检查。每一人份的尿样以Fisher 锥形管保留，选用不同规格的保留管，可作双份备份，例如 15 ml×2 管，50 ml×2 管，等。–25℃保存。

1.1.3 组织标本 ①石蜡组织：将手术切除的肝癌及癌周肝组织按病理组织切片常规固定、脱水、透明、浸蜡和包埋，一般常温下可以保存。②新鲜组织：在完成组织学诊断后，将剩余的肝癌及癌周肝组织根据实验用量，分成若干份，液氮或 –80℃保存。

1.2 保留管的选择

1.2.1 塑料管 20 世纪 80年代，限于当时的条件，采用Ф 4mm 的塑料管吸取血清。具体方法是按保留血清的量截取合适长度的塑料管，置入血清，然后两头用酒精灯烘热软化、用止血钳进行封口保存。我们曾经采用此法保留了 1 万多份的血清样本。实践证明，用这种“原始”方法保存了10 多年的血清仍然有效[2]；近年来这些血清被应用于分子生物学研究，也未见血清存在质量问题[3]。在当时的条件下，这种方法不失为一种花费少、占地小、适用于基层单位保留大量标本的方法。该法的缺点是不能有序排列，寻找血样时较麻烦，再次分装或二次应用不方便，不能液氮或 –80℃保存（易折断）。

1.2.2 液氮冻存管 近 20年来，我所实验室使用液氮冻存管保留生物样本。按照需要保留的样本量选择冻存管的大小，常用规格有 1.2 ml 或 1.5 ml。冻存管体积不大且能安放有序，能耐受深低温，是理想的保留血清（浆）和白细胞的容器。在选择商品时，我们的做法是要求厂商提供小样，不仅外观质量符合要求，还需经液氮或 –80℃冻存一周以上，经检查无冻裂、无变形才确定选购。

1.3 分类编号

1.3.1 标签制作 相对而言，采血管上的标签信息是“暂时”的，而保存管上的标签信息是“长期”的。早年用胶布粘贴后手写或直接用油性记号笔标记标签，20 世纪 90年代起逐步用激光打印机打印不干胶标签，更有利于样本的长期保存。在大规模的采样工作中，因为都是直接面对被采用者，所以现场书写标签是常用的方法：具体做法是采用共同标识部分先行打印在采样管上，而被采样者的个人信息则在现场书写，这样做既可以节约时间又方便操作。

1.3.2 统一编号 每个队列的每份样品，在采集前都被确定一个唯一的编号，有队列代号、采样年月、个体序号等；对于队列中同一对象多次随访采样者的标号，必须有共同标识号及逐次标识号，既体现号码的连贯性、又能方便区别不同时点样本的特征。编号的另一个作用是借此可以连接数据库（书面和电子）和标本库，确保所保存的各个标本或编号具有唯一且准确的信息。

1.4 保存条件

–25℃冰箱：用于血清（浆）和尿样标本的存放；–80℃超低温冰柜：用于保留外周血白细胞、部分血清和手术切除标本；液氮储存罐：主要用于保留新鲜组织标本和细胞株（系）。例如体外培养的启东人体肝癌细胞系、癌周肝组织及甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）单克隆抗体细胞系等。

2 样本的收集

2.1 “被动”收集生物标本

启东生物标本的检测可以追溯到 20 世纪 70年代，当时流行病学研究的重点是摸索肝癌的主要病因，因此，多学科研究主要通过分析土样、水样（理化指标、卫生指标及污染指标等）甚至动物标本等作地区、人群及对照的差异分析[1,4]。20 世纪 80年代，随着对保存生物标本重要性认识的提高，以及标本保存条件的逐渐成熟，我们结合科研项目，在完成专题需要的生物标本检测后，对检测后剩余的标本进行收集保存。例如 20 世纪80年代末，我们开展高危险人群的肝癌筛检项目[5-6]，在完成 HBsAg、AFP、肝功能（ALT）等常规检测后，我们对所有 HBsAg 阳性者的血清都作了保留；对 HBsAg 阴性者，也按比例作了保留。

2.2 “主动”收集生物标本

20 世纪 80年代，随着免疫组化研究及癌基因研究的进展，肝癌病理组织标本及生物标本收集的意义愈发显得重要。20 世纪 90年代，因研究工作的深入和课题的需要，我们开始主动收集并保存生物学标本。例如在国际协作项目中，为研究黄曲霉毒素与肝癌的关系，评价化学预防对尿中黄曲霉毒素加合物的影响，在一定的时间段内，我们每天收集受试者的尿液，低温保存备作后期的测试应用[7-8]。再如近年我们参加了国家重大科技专项“生物标本库”的建立，按照设计要求，“主动”收集高发家系、双生子家系及高危险人群及肝癌病例的生物学标本。临床肝癌病理标本，也在不断收集、冻存。

2.3 现有样本数

目前我们已经建立了数个来自不同研究目的的样本库，包括化学预防研究、生物标志物研究、危险因子研究、双生子遗传资源、肝癌家系、肝癌病例对照研究、肝癌筛检及肝癌免疫预防等标本库，主要收集血清、血浆、尿液等生物学标本。此外，本所还保留肝癌的手术标本[石蜡块及（或）新鲜组织]，有些还结合上述研究项目对象中出现的肝癌同时保存患者的组织学标本。现有标本库及样本数见表1。

表1 启东生物标本库

3 样本的应用

3.1 应用于主题设计的研究

3.1.1 “即时”研究 根据设计要求确定对象、确定检测项目，用于该专题研究。这是临床和实验研究最常用的方法。其特点是，在样本数上—需要多少采多少；在样本量上—据实验需要量用多少采多少；在时间上—即采即用，不作保存。例如临床常规检验。

3.1.2 “延时”应用 根据设计，统一采集，多适用于现场采集，然后集中到有条件的上级机构或实验室集中检测、统一检测。其特点是，在检测技术上—可能是基于工作流程、实验试剂或质量控制的考虑；在时间上—先采后用，先临时保存、后检测使用；最终也不再保存样本。例如一次性的普查采样。

3.2 应用于项目的深入研究

3.2.1 预试研究 项目出于经费的考虑，先获取部分样本，然后分批检测分析样本；或者为实施较大的项目，先作前期的预试采样。也可能是基于实验技术的考虑，先试探性地检测小样，待条件成熟时统一检测。因此，在样本的处理上，实行先（前）采后用；这些样本做完后，有时也需要继续保存以备复检或正式实验时再用，也可能需要保留较长的时间。

3.2.2 扩大研究 有些实验指标表现为“低频率”水平，因此需要较大的样本量。这也是基于减少抽样误差、提高统计学数量效率的考虑。在这种情况下，一段时间内的样本，或者一个地区范围内的样本量远远不能满足实验之需，因此需要累积采样。例如多学科的研究、多中心的研究。这些样本，不仅有采样对象、采样数量的要求，而且还有统一的采样标准、保存条件的要求。

3.3 应用于历史比较研究

3.3.1 回顾比较 保存良好的标本，特别是同一人或者同一类的标本，不仅可为当时的研究提供检测依据，而且还为后来的研究提供比较的基准。当这个人或这类人后来发生了某种疾病后，通过其与历史标本指标的比较，寻找与目前疾病之间可能的联系，从而做到“古（过）为今用”，类似于由“果”到“因”的研究[3]。例如验证新“发现”的诊断标志物，用患者的历史标本验证，可以赢得随访确认的时间[9]。

3.3.2 前瞻比较 队列研究是最经典的前瞻研究。它通过建立观察者队列，定期随访，采集标本并比较生物标本中所观察指标的变化，及时发现异常，为临床及实验研究提供依据。前瞻研究是由“因”到“果”的研究，这个“因”可能是生物标本中的某个、某些或某类指标，通过现有标本中指标的测定，或者将现有标本保存到前瞻终止期时，与那时的标本作比较研究，从而揭示某种联系或“因果”关系[10-11]。

3.4 应用于将来的开发研究

3.4.1 “可见”未来的研究 现有的技术、知识和证据能够预期未来短期内建立实验方法或发现新的标志物对现有人群的生物样本进行检测、分析，但目前尚不能确定具体的检测标志物或尚不能建立确定的随访队列。在此情况下，提前采集患者或受试对象的生物学标本，以备“可见”未来之用。这种设计可能适用于有较强研发实力的课题组或有长期计划的研究机构。

3.4.2 建立生物标本库 建立生物标本库是一个系统工程。它是系统地有目的地收集特定人群的生物标本，以备作“将来”的研究。这个“将来”，可能没有具体的时限，因此样本需要长期保存。例如我们收集的双生子遗传资源、国家重大科技专项“样本库的建立”等。

4 样本库的维护与随访

4.1 现有标本的维护

4.1.1 有序 当研究工作需要获取若干年前某一批（份）样本时，要快速、正确地在庞大的样本库中找到，必须做到有序存放。我们的样本库做到项目分开、样本种类分开，且按照样本采集年份、样本编号排序存放，方便查找、取样。同时建立对应的样本库电子档案。

4.1.2 安全 供电保障是样本库安全的重中之重。我们的样本库供电系统采用专线专用，设立报警系统，定期检查。其次，冰柜中留有适当空间，有利于冷气循环；适时除霜，保证冰柜保持良好的致冷效果等，都是安全冷冻的必要工作。此外，样本库安全还包括：有专人负责日常维护，无关人员不得擅自进入，样本调用需获得课题负责人同意等。

4.1.3 长期 样本库的建立与随访是一项长期的、承前启后的工作，20 多年来，我们的样本库日复一日、年复一年地收集了大量的生物样本，且今后有必要更加规范化地做好这方面的工作，因此在设计、实施过程中，要着眼于长期，除了添加设备、完善基本设施外，尤其要做好落实日常保存和维护工作。

4.2 队列对象的随访

已经建立的各项目队列既是我们开展肝癌防治研究的基本保证，也是队列对象获得肝病早诊早治的有力保障。大多数的队列对象能够得到一年一次或一年两次的免费检查。20世纪 80年代，普查的主要方法是血清学检测，血清学检测异常者给予 B 超检查；90年代以来，普遍采用血清学检测和 B 超检查相结合的方法进行普查[6,12]。同时对每次接受随访、普查的队列对象，核对其有效证件和基本信息，记录队列对象的转归、疾病、死亡等相关信息。此外，对队列人群给予充分的关心，建立良好的信任关系，也是提高队列人群随访顺从率的一个重要措施。

5 样本库完善的思考

5.1 基本的设施

样本库的基本设施包括：可控温度的房间、冰箱（柜）、液氮罐。因地制宜、因陋就简、逐步发展、不断完善，是我们近 30年来样本库建设走过的路程。

5.2 伦理与安全

5.2.1 知情同意和签署知情同意书 让受试者了解项目研究的目的、益处和可能的风险，样本的使用范围和结果的处理等。手术标本的获取同时需要按照医疗规范规定的方式取得患者的术前知情同意。

5.2.2 自愿原则 在说明项目研究目的后，请受试者考虑自愿参加，并允许参加者中途退出。对于老弱孕童者，则不纳入“自愿”项目。

5.2.3 结果告知 对所有的患者告知基本检测项目特别是疾病筛查体检的结果。在启东特定的条件下，不论何种原因收集血样标本，我们还同时给受试者免费检查 AFP、HBsAg、ALT 并转告检验结果，对异常者给出建议性的处理意见。

5.2.4 防止交叉污染 在自然人群筛查或疾病专项筛查时，一般都包括健康人群和患病人群，为防止交叉感染或污染，严格实行“一人一针一管”的采血原则。

5.2.5 符合国际惯例 在国际协作中，我们既要做到符合中国人类遗传资源管理的相关规定，同时也要符合协作国的相关规定。协作双方要签署合作协议，明确双方责任与义务，以及可能的专利或版权的共享。例如在与美国科研机构的协作中，同时要注册相应的 IRB（Institutional Review Board）及 FWA（Federalwide Assurance）的条款[13]。

5.3 稳定的队列人群

样本收集的目的是检测并评价受试患者或人群。因此，首先需要选择并确定目标人群（队列人群），例如评价乙型肝炎表面抗原（HBsAg）与肝癌的关系，就选择HBsAg携带者队列进行长期的采样观察[10-11]。来自稳定的队列人群的样本，对于样本结果的准确评价与推论具有重要的意义，更能反映样本所代表人群的真实的生物标志物情况。例如根据启东多个队列人群（包括患者人群）采样的研究，发现启东人群中抗-HCV 阳性率较低，而启东人群中 HBV 基因型以C 型为主。

5.4 受试者的顺从率

队列样本采集中，需要对受试者进行多次随访采样，因此受试者的顺从率也可能对人群样本的代表性产生影响。特别是在固定队列人群的定期随访中，受试者的随从率可以使样本分析的效率提高、误差减少。在现场工作中，为提高受试者的顺从率，必须从一开始就做好宣传发动工作，签署知情同意书，说明要长期观察、多次采样，预先把一些可能因多种原因而不能坚持参加的对象剔除，可使队列对象的顺从率大大提高。例如我们在实施化学预防服药的研究中，受试者被要求每天提供尿液，这种系列尿液样本的分析，比单一尿样的分析将更具科学性，并且能够比较尿中生物标志物代谢的时间关系[7-8]。

5.5 统一采样和处理

5.5.1 采血前的准备 根据样本检测或保留标本使用的要求，选用合适的试管、采集合适的样本量、决定是否使用抗凝剂。

5.5.2 采血后的处理 及时分类、分装、检测，及时保存，采用一次性吸管吸入保存管，防止标本保存过程中的交叉污染。

5.6 标本数据库的管理、开发与问题

标本库的建立来源于项目、应用于项目，并且要借助基本的硬件设备进行保存、管理。启东的生物标本库是在完成研究项目的基础上逐步建立、积累起来的，并且大部分的样本来源于队列研究。事实上，近期建立的专题标本库也是根据主题设计而系统地收集特定对象（人群）的生物标本，因此，从标本库管理的角度看，这也是一种队列标本的管理。

目前我所的标本管理就是一种“队列”标本库的管理，从标本的存放、数据库的管理都以队列项目为主线，以项目课题组为管理单元。这种管理的优点是目的明确、主题清晰、样本的时间序列容易把握、管理方便。但各队列样本库分别管理的缺点是样本存放相对分散、资源利用率相对较低，不便于样本的集中调度和统筹、不便于队列样本库之间的综合应用。

6 展望

在启东 30 多年的肝癌现场研究中，通过大量生物标本的分析、特别是队列样本的分析，已经为肝癌的流行病学研究[1,4,10-11]、病因机制研究[3,7-11]、早诊早治及生物标志物的研究[3,5-6,12]以及预防研究[14]提供了宝贵的生物学基础资料和实验证据资料，在国内、国际的合作研究中产生了积极的影响。随着分子生物技术的不断进步，生物标本的应用前景将愈发广泛，生物标本库的作用和地位将进一步提高。我们将利用承担国家重大科技专项“生物标本库建立”课题的契机，完善以队列样本库为基础的生物标本库的管理，建立编号、登记、分类、存放、管理和使用的标本建库和调用的工作流程，使启东的生物标本库，在完成各承担专项课题的前提下，成为符合生物资源利用原则的、开放性的生物标本库平台，为启东乃至我国的癌症研究、为国际协作研究积累并提供生物标本资源。

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