含人Fc重组凋亡融合蛋白体内外抗肿瘤活性初步研究

罗岚，刘洪洪，李祥，范开

1995年Wiley 等[1]利用表达序列标签（EST）的方法在人心肌细胞 cDNA 文库中鉴定出肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族凋亡诱导分子的一个新成员——肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL），TRAIL 通过与其相关受体结合，可诱导细胞发生凋亡。与 TNF 家族的另外 2 种凋亡诱导分子（TNF-α、Fas-L）相比，TRAIL 具有如下特点：①持续地表达于大多数正常细胞中，具有强大诱导肿瘤细胞凋亡的能力，且对正常细胞基本无影响；②比 Fas-L 具有更广的抗癌谱；③对核因子NF-κB 仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会产生类似 TNF-α 的严重炎症反应。因此，TRAIL 被认为是一种更为安全且极具潜力的抗肿瘤蛋白[2]。

TRAIL 重组蛋白主要利用大肠杆菌以包涵体形式表达，经复性、纯化后得到含 Zn2+的三聚体活性结构。目前，TRAIL 重组蛋白已进入临床研究阶段，美国 Amgen/gentech 公司研发的 TRAIL 重组蛋白产品已进入 II 期临床试验阶段，在国内相同 TRAIL 重组蛋白产品也已进入 I、II 期临床试验阶段，研究结果显示 TRAIL 重组蛋白联合化疗的抗肿瘤疗效明显，但半衰期较短[3]。为了进一步证实其作用，我们对 CHO 真核表达系统制备的含人抗体 Fc 片段的 TRAIL（TRAIL-Fc）重组融合蛋白在体内外的抗肿瘤活性进行了初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 TRAIL-Fc 重组融合蛋白冻干粉，1 mg/支，纯度 95%，由 CHO 真核表达系统表达制备，其中人 IgG 抗体 Fc 片段位于重组融合蛋白的 C 端，TRAIL 蛋白位于其 N 端，购自重庆富进生物医药有限公司；TRAIL 对照品冻干粉，1 mg/支，纯度 95%，由大肠杆菌表达制备，购自深圳新鹏生物工程有限公司；5-氟尿嘧啶注射液（5-Fu），10 ml/0.25 g，购自上海旭东海普药业有限公司；RPMI-1640、DMEM 培养基和胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其余试剂均为国产分析纯。Spectra MAX 190 全波长酶标仪为美国Dynex公司产品。

1.1.2 细胞株 人急性 T 淋巴细胞白血病Jurkat 悬浮细胞、人结肠癌 LOVO 贴壁细胞、人胃癌 MKN45 贴壁细胞、人表皮癌 A431 贴壁细胞、人肝癌 HEPG2 贴壁细胞、人乳腺癌 MCF-7贴壁细胞均购自上海细胞库和武汉大学中国典型培养物保藏中心，由重庆富进生物医药有限公司传代保存。其中 Jurkat 细胞培养于含 10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的RPMI-1640 完全培养液中，其余细胞均培养于含10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 完全培养液中，置于 37℃、5%CO2的孵箱中培养。

小鼠肝癌 H22 悬浮细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，培养于含 10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 RPMI-1640 完全培养液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培养。

1.1.3 实验动物 雄性 BALB/C 小鼠 40 只，6～8 周龄，体重（20±2）g，购自重庆医科大学动物实验中心[合格证号：SYXK（渝）2002007]，饲养于重庆医科大学实验中心 SPF 级动物房。

1.2 方法

1.2.1 体外抗肿瘤活性 采用 MTT 法检测。调整 Jurkat 悬浮细胞、H22 悬浮细胞的密度为1×105个/ml，其余 5 种贴壁细胞 LOVO、MKN45、A431、HEPG2、MCF-7 分别用 0.25%的胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为5×104个/ml。实验分TRAIL-Fc 重组融合蛋白组、对照组和空白对照组，每组各设 2 个复孔。将细胞均接种于 96 孔板中（100 μl 孔），置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，分别加入含 1000、250、62.5、15.6、3.9、0.97 ng/ml TRAIL-Fc 重组融合蛋白和 TRAIL 对照品的完全培养液各 100 μl，同时以加入 100 μl 完全培养液作为空白对照组。各组细胞经不同处理后继续培养 24 h，每孔加入 10 μl 浓度为5 mg/ml的 MTT，继续培养 4 h 后，贴壁细胞直接吸弃培养上清液，悬浮细胞离心后吸弃培养上清液，每孔加入 100 μl 的 DMSO，微量振荡仪振荡 5min，在 Spectra MAX 190 全波长酶标仪上测定各孔于波长 570 nm 处的吸光度（A570）值，按下列公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率（%）=（1 － 实验孔A570/对照孔A570）×100%，并绘制细胞生长抑制率曲线，计算半数抑制浓度（IC50）。

1.2.2 体内抗肿瘤活性 选取 H22 细胞分别行腹腔和腋下接种建立小鼠肝癌模型。调整 H22 悬浮细胞密度为1×107个/ml，0.3 ml/只接种于BALB/C 小鼠腹腔内，10 d 后抽取小鼠腹水，调整细胞密度为1×107个/ml，再分别对小鼠进行腹腔和腋下接种。待接种 3 d 后，据治疗药物的不同将小鼠随机分为空白对照组、5-Fu 组和 TRAIL-Fc重组融合蛋白组，每组 6 只，给药途径均为腹腔内注射。其中空白对照组每只每天注射生理盐水0.3 ml，5-Fu 组每只每天注射剂量为25 mg/kg，TRAIL-Fc 重组融合蛋白组每只每 3 天的注射剂量为10 mg/kg。

给药后每天测量并记录腹腔接种肿瘤小鼠的腹围和体重，接种后第5 天开始每天测量腋下接种肿瘤小鼠的肿瘤体积，肿瘤体积（TV）的计算公式为TV（mm3）= 1/2×a×b2，其中 a、b 分别表示肿瘤的长径和短径。接种后第15 天结束实验，摘除眼球取外周血后处死各组小鼠，剥取瘤块称重，计算抑瘤率，计算公式为抑瘤率（%）=（1 －实验组平均瘤重/空白对照组平均瘤重）×100%。收集各组小鼠外周血，经离心后获取血清，送至重庆市九龙坡区第一人民医院检测血清中 AST 及ALT 含量，观察肝脏功能损伤情况。

2 结果

2.1 TRAIL-Fc 重组融合蛋白的体外抗肿瘤活性

以250 ng/ml TRAIL-Fc 重组融合蛋白处理肿瘤细胞 6～8 h 后，镜下观察显示 7 种细胞均出现脱落变圆、胞质皱缩、体积缩小等凋亡表现（图1）。

对 7 种肿瘤细胞株的体外生长抑制作用实验结果表明，分别加入不同浓度的 TRAIL-Fc 重组融合蛋白后，所有肿瘤细胞生长均受到不同程度的抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖效应（图2）。其中对 MCF-7 细胞的抑制作用最强，其最大生长抑制率为82.5%；其次依次为LOVO、MKN45、H22、Jurkat、HEPG2 细胞，其最大生长抑制率分别为81.9%、52.3%、51.2%、50.9%、35.4%；而对 A431细胞的抑制作用最弱，其最大生长抑制率为20.3%。

TRAIL-Fc 重组融合蛋白对 7 种肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50）结果显示，与 TRAIL 对照品相比，TRAIL-Fc 重组融合蛋白对 LOVO、MKN45、MCF-7 细胞更敏感（表1）。

图1 250 ng/ml TRAIL-Fc 重组融合蛋白体外作用 8 h 后LOVO 细胞的形态学观察 相差显微镜×100（A：TRAIL-Fc 重组融合蛋白组；B：空白对照组）Figure 1 Morphology of LOVO cells treated by 250 ng/ml TRAIL-Fc recombinant fusion protein for 8 h in vitro (Phasecontrast microscopemicroscopy, original magnification×100)(A: TRAIL-Fc recombinant fusion protein group; B: Blank control group)

图2 MTT 法检测 TRAIL-Fc 重组融合蛋白对 7 种肿瘤细胞的体外生长抑制作用（A：MKN45 细胞；B：LOVO 细胞；C：MCF-7 细胞；D：HEPG2 细胞；E：Jurkat 细胞；F：A431 细胞；G：H22 细胞）Figure 2 The growth inhibition effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on 7 kinds of tumor cell lines by MTT method in vitro.A: MKN45 cells; B:LOVO cells; C: MCF-7 cells; D: HEPG2 cells; E: Jurkat cells; F: A431 cells;G: H22 cells.

2.2 TRAIL-Fc 重组融合蛋白的体内抗肿瘤活性

接种 H22 细胞建立小鼠肝癌模型进行体内抗肿瘤活性实验的结果显示，腹腔接种 10 d 后，空白对照组小鼠腹水增加，腹部明显膨出；TRAIL-Fc重组融合蛋白组小鼠腹部仅轻微膨胀；5-Fu 组小鼠极度消瘦，腹部无膨胀。自给药后每天测量各组小鼠体重，其中 TRAIL-Fc 重组融合蛋白组小鼠体重维持较好，未见明显变化；空白对照组小鼠后期体重略有下降；5-Fu 组小鼠体重急剧下降（图3A、表2）。

表1 TRAIL-Fc 重组融合蛋白对 7 种肿瘤细胞体外生长抑制的敏感性Table 1 The sensitivities of TRAIL-Fc recombinant fusion protein to 7 kinds of tumor cell lines growth inhibition in vitro

图3 H22 细胞荷瘤小鼠分别注射生理盐水、5-Fu 和TRAIL-Fc 重组融合蛋白后的体重变化和肿瘤体积生长曲线（A：腹腔接种后各组小鼠的体重变化曲线；B：腋下接种后各组小鼠的肿瘤体积生长曲线）Figure 3 The curves of tumor volume and body weight of H22 celles tumor-bearing mice injected by normal saline, 5-Fu,or TRAIL-Fc recombinant fusion protein respectively.A: The curves of body weight of mice injected H22 celles into abdominal; B: The curves of tumor volume of mice injected H22 celles into armpit.

图4 接种 15 d 后 H22 细胞腋下荷瘤小鼠瘤块（每组 6 只）Figure 4 The tumor of mice injected H22 cells into armpit after 15-day (6 mice in each group)

H22 细胞腋下荷瘤小鼠，接种 5 d 后每天测量肿瘤体积，其中 5-Fu 组肿瘤体积明显缩小，TRAIL-Fc 重组融合蛋白组肿瘤体积后期略有增加，空白对照组肿瘤体积持续显著增加（图3B）。接种 15 d 后结束实验，剥取各组小鼠瘤块称重并计算抑瘤率，其中 TRAIL-Fc 重组融合蛋白组抑瘤率为45.79%，5-Fu 组小鼠未见瘤块（图4、表2）；取小鼠血清进行 AST 和 ALT 检测，结果显示 TRAIL-Fc 重组融合蛋白对小鼠肝功能无明显影响（表3）。

表2 接种 15 d 后 H22 细胞荷瘤小鼠的体重和瘤重（±s）Table 2 The body weight and tumor weight of H22 celles tumor-bearing mice after 15-day injection (±s )

表2 接种 15 d 后 H22 细胞荷瘤小鼠的体重和瘤重（±s）Table 2 The body weight and tumor weight of H22 celles tumor-bearing mice after 15-day injection (±s )

小鼠体重（g） Body weight of mice (g)组别Groups 实验前 Before experiment 实验后 After experiment瘤重（g）Tumor weight (g)空白对照组 Blank control group 18.18±1.08 17.33±1.42 3.21±0.61 5-Fu 组 5-Fu group 17.92±1.81 12.21±1.16 0 TRAIL-Fc 重组融合蛋白组 TRAIL-Fc recombinant fusion protein group 17.64±0.69 16.48±1.62 1.74±0.46

表3 接种 15 d 后 TRAIL-Fc 重组融合蛋白对 H22 细胞荷瘤小鼠肝功能的影响（±s）Table 3 The effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on H22 celles tumor-bearing mice liver function after 15-day injection (±s )

表3 接种 15 d 后 TRAIL-Fc 重组融合蛋白对 H22 细胞荷瘤小鼠肝功能的影响（±s）Table 3 The effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on H22 celles tumor-bearing mice liver function after 15-day injection (±s )

组别Groups AST (U/L) ALT (U/L)空白对照组Blank control group 16.00±1.84 7.00±0.42 5-Fu 组5-Fu group 38.00±6.01 47.00±5.73 TRAIL-Fc 重组融合蛋白组TRAIL-Fc recombinant fusion protein group 22.00±4.36 11.00±1.45

3 讨论

TRAIL因具有广泛诱导肿瘤细胞凋亡作用而对正常细胞基本无毒性的特点，而有望成为一种既有效又安全的肿瘤治疗药物。但已有报道 TRAIL对正常肝细胞有杀伤作用，如在体外大剂量 TRAIL重组蛋白（如 His-TRAIL[4]、用抗体铰链的 FLAGTRAIL[5]）对新鲜分离的人原初肝细胞有毒性，而天然 TRAIL 对正常人肝细胞则无毒性[6]，这将有可能限制 TRAIL 重组蛋白的抗肿瘤临床应用。

与大肠杆菌表达的 TRAIL 重组蛋白相比，通过 CHO 真核表达系统表达制备的 TRAIL-Fc 重组融合蛋白具有更多的优势，如无需蛋白复性、具有天然 TRAIL 构象、附有糖基化修饰等。同时通过与抗体 Fc 片段融合后其体内半衰期延长，减少了 TRAIL 可能带来的肝细胞毒性。此外，由抗体Fc 片段介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）还可增强 TRAIL 的体内抗肿瘤作用。

在本研究中，体外抗肿瘤活性实验结果表明，TRAIL-Fc 重组融合蛋白具有较强的抑制肿瘤细胞生长的能力。分别加入不同浓度的 TRAIL-Fc 重组融合蛋白后，所有肿瘤细胞生长均受到不同程度的抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖效应，其中抑制作用最强的是 MCF-7 细胞和 LOVO 细胞；并且所有细胞均出现脱落变圆、胞质皱缩、体积缩小等凋亡表现，初步证实了该蛋白是通过诱导细胞凋亡的方式从而抑制肿瘤细胞生长。体内抗肿瘤活性实验结果表明，以每 3 天 1 次的给药频率，TRAIL-Fc重组融合蛋白能够有效抑制小鼠腹腔及腋下荷瘤细胞的生长。由此可推断，通过与抗体 Fc 片段融合后，TRAIL 在体内的半衰期明显延长。但有关TRAIL-Fc 重组融合蛋白抑制肿瘤细胞生长与凋亡的具体作用机制，及其体内最低有效剂量和半衰期等问题，还有待进一步研究。

[1]Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity, 1995, 3(6):673-682.

[2]Fan XG.T cells express TRAIL receptors.Immunol J, 2000, 16(4):316.(in Chinese)范学工.TRAIL受体的T细胞表达.免疫学杂志, 2000, 16(4):316.

[3]Yee L, Fanale M, Dimick K, et al.A phase IB safety and pharmacokinetic (PK) study of recombinant human Apo2L/TRAIL in combination with rituximab in patients with low-grade non-Hodgkin lymphoma.J Clini Oncolo, 2007, 25(18):8078.

[4]Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Biol Chem, 1996, 271(22):12687-12690.

[5]Schneider P.Production of recombinant TRAIL and TRAIL receptor:Fc chimeric proteins.Methods Enzymol, 2000, 322:325-345.

[6]Ganten TM, Koschny R, Sykora J, et al.Preclinical differentiation between apparently safe and potentially hepatotoxic applications of TRAIL either alone or in combination with chemotherapeutic drugs.Clin Cancer Res, 2006, 12(8):2640-2646.