头孢哌酮钠和卡那霉素在豚鼠化脓性中耳炎中的作用及耳毒性机制研究

简 雷 蔡昌学

(1武汉商业职工医院耳鼻喉科,武汉430021;2华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系,武汉430030)

化脓性中耳炎是中耳粘膜、骨膜或深达骨质的化脓性炎症,常与乳突炎合并存在[1]。本病是耳鼻咽喉科常见疾病之一。临床上以耳内反复流脓、鼓膜穿孔及听力减退为特点。严重者可使中耳传音结构受到破坏,引起严重的颅内、外并发症而危及生命。近年来由于抗生素的广泛应用,耐药菌株不断产生和增加,给化脓性中耳炎的治疗带来了困难[2]。

中耳炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌,因此利用金黄色葡萄球菌中耳炎的动物模型可以更好的了解和防治该疾病。卡那霉素是一种氨基糖苷类广谱抗生素,主要对革兰阴性菌如克雷伯菌属、变形杆菌属、肺炎杆菌等具有良好抗菌作用。卡那霉素对耐药性金黄色葡萄球菌也有良好的抗菌作用。卡那霉素主要与细菌核糖体30S亚单位结合,抑制细菌蛋白质合成。头孢哌酮钠是第三代广谱半合成头孢菌素,能对抗多种β-内酰胺酶的降解作用,抗菌谱广,对革兰阳性菌及阴性菌都有作用。临床上主要用于敏感菌引起的各种感染[3]。为了解金黄色葡萄球菌中耳炎的耐药特点,本课题将在化脓性中耳炎的豚鼠模型上使用卡那霉素和头孢哌酮钠,以探讨不同类型抗生素在豚鼠化脓性中耳炎中的抗炎作用和耐药性,做到合理使用抗生素。

材料和方法

1.动 物分组及处理

45只健康白色赤目纯种雄性豚鼠,耳廓反射灵敏,体重350g-400g,鼓膜完整,结构标志清楚,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。豚鼠在显微镜下右侧鼓膜前下方穿刺,向鼓室内注射制备的浓度为108CFU/L金黄色葡萄球菌悬液0.2 ml,左耳注入0.2 ml无菌生理盐水作为对照。隔2天显微镜下右侧鼓膜无菌条件下沿前次注射针孔再次向鼓室内注射制备的浓度为108CFU/L金黄色葡萄球菌悬液0.2 ml,左耳同法注射0.2 ml无菌生理盐水。再隔2天重复一次,共注射3次。最后1次注射完成24h后,显微镜下观察:豚鼠右耳鼓室内有脓液,鼓膜显著充血、红肿,细菌培养为接种的金黄色葡萄球菌者作为化脓性中耳炎模型。按照实验计划,三组豚鼠右耳分别给予卡那霉素滴耳剂、头孢哌酮钠滴耳剂和生理盐水。每只右耳滴药0.2 ml,使药液充满外耳道,维持10min后清理干净,每天2次,连续给药7天。

2.听 性脑干反应

将豚鼠用10%水合氯醛按0.25 mg/Kg体重麻醉,刺激声为短音,重复率为20次/秒,平均叠加次数为1024KHz,扫描时间为10ms。记录电极位于豚鼠颅顶,给声耳及对侧耳后皮下分别刺入参考电极和接地电极。ABR的阈值按豚鼠的Ⅲ波作为标准。金黄色葡萄球菌菌苗中耳腔注射前检测一次,排除听力异常的豚鼠,选取正常者为研究对象;造模成功后和抗生素滴耳后分别检测1次,得到其阈值。

3.细 菌培养

给药结束后,将豚鼠麻醉并断头处死,取出右耳听泡,在耳蜗顶打开一个小孔,在显微镜下观察中耳腔内炎症情况。根据脓性分泌物多少进行评分:0分表示无脓性分泌物,1分表示脓性分泌物占中耳腔容积的1/3,2分表示脓性分泌物占中耳腔容积的2/3,3分表示脓性分泌物充满整个中耳腔。然后取中耳腔分泌物接种于琼脂培养基平板上,37℃培养18小时,再进行菌落计数。以上操作均在无菌条件下进行。

4.耳 蜗基底膜铺片和形态学观察

将取出的右耳听泡打开圆窗和前庭窗,在耳蜗蜗尖打开一个小孔,用4%多聚甲醛室温固定1小时后,在PBS中分离耳蜗基底膜。将基底膜置于玻片上,用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色液(PBS稀释倍数为1:250)滴在基底膜上,室温避光保存30分钟。然后将染色标本用 PBS清洗5次后,将碘化丙锭染色液(5 ug/ml)滴在基底膜上,室温避光保存10分钟。然后用 PBS清洗标本,最后滴上抗荧光退变剂封片。荧光显微镜下观察损伤毛细胞的形态学变化,共聚焦显微镜下拍照。

5.统 计学分析

采用SPSS13.0统计学软件,数据以均数±标准差(¯x±s)表示。各组间差异采用方差分析,P>0.05差异无统计学意义;P<0.05有显著差异,采用LSD-t检验进行各组均数间两两比较。

结 果

1.各 组ABR阈值

如表1所示,同一组内造模前和造模后ABR阈值差异有统计学意义,表明化脓性中耳炎豚鼠模型造模成功。造模前和造模后各组间ABR阈值差异无统计学意义(P>0.05)。实验后各组ABR阈值,头孢哌酮钠组和卡那霉素组均低于生理盐水组,其差异有统计学意义(P<0.05)。头孢哌酮钠组ABR阈值低于卡那霉素组,其差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 实验前后各组ABR阈值(n=15,¯x±s,dB peSPL)T able 1 ABR threshold before and after the modeling as well as during the whole period of experiment(n=15,¯x ±s,dB peSPL)

2.脓 性分泌物评分和菌落计数

给药结束后,将豚鼠麻醉并断头处死,取出右耳听泡,观察中耳炎症情况:如表2所示,头孢哌酮钠组和卡那霉素组脓性分泌物比生理盐水组少,其结果差异有统计学意义(P<0.05)。头孢哌酮钠组与卡那霉素组之间脓性分泌物结果相似,差异无统计学意义(P>0.05)。卡那霉素组细菌菌落计数较少,头孢哌酮钠组较多,生理盐水组最多。头孢哌酮钠组和卡那霉素组均低于生理盐水组,其差异有统计学意义(P<0.05)。头孢哌酮钠组高于卡那霉素组,其差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 实验后各组中耳炎脓性分泌物评分和菌落计数(¯x±s)T able 2 The infiltrating status of inflammatory cells in middle ear mucosa and the number of bacterial flora(¯x ±s)

3.耳 蜗基底膜形态学观察

如图1所示,生理盐水组(A组)三排外毛细胞排列整齐,红色 PI染色的毛细胞核大小一致,染色均匀,外形规则,排列有序,无明显细胞核缺失,绿色FITC染色纤毛呈V型排列,表皮板完好,结构正常;头孢哌酮钠组(B组)可见三排外毛细胞排列整齐,红色毛细胞核大小一致,染色均匀,外形规则,排列有序,绿色纤毛呈V型排列,表皮板完好,结构正常;卡那霉素组(C组)可见三排外毛细胞核均有不同程度的缺失,第一排损伤最严重,呈现大片缺失,相同部位的纤毛和表皮板也可见缺失。

图1 基底膜形态学观察(n=6)A、B、C分别是生理盐水组(A组)、头孢哌酮钠组(B组)和卡那霉素组(C组)基底膜铺片的典型形态图。白色箭头示损伤的外毛细胞,黄色箭头示缺失的纤毛和表皮板。Fig.1 Surface preparation technique of the basilar membrane(n=6)A,B,C representsurface preparation morphological changes of the basilar membrane in saline group,cefoperazone sodium group and kanamycin group,respectively.

讨 论

中耳炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌[4-6],因此利用金黄色葡萄球菌中耳炎的动物模型可以更好的了解和防治该疾病。卡那霉素是一种氨基糖苷类广谱抗生素,主要对革兰阴性菌如克雷伯菌属、变形杆菌属、肺炎杆菌等具有良好抗菌作用。卡那霉素对耐药性金黄色葡萄球菌也有良好的抗菌作用。卡那霉素主要与细菌核糖体30S亚单位结合,抑制细菌蛋白质合成[7]。但是,氨基糖苷类抗生素具有耳毒性,约5%的病人会导致明显听力下降。头孢哌酮钠是第三代广谱半合成头孢菌素,能对抗多种β-内酰胺酶的降解作用,抗菌谱广,对革兰阳性菌及阴性菌都有作用。临床上主要用于敏感菌引起的各种感染[8]。

在本研究中,ABR的结果显示生理盐水组听力损失最严重,卡那霉素组其次,而头孢哌酮钠组最轻。脓性分泌物评分和菌落计数的结果显示,卡那霉素组脓性分泌物和菌落数最少,头孢哌酮钠组其次,而生理盐水组脓性分泌物和菌落数最多。根据脓性分泌物评分和菌落计数的结果,我们推测,卡那霉素和头孢哌酮钠均有显著的抗金黄色葡萄球菌的作用,而且卡那霉素的抗菌作用强于头孢哌酮钠。但是ABR的结果显示,卡那霉素组的听力比头孢哌酮钠组听力差。因此,我们推测卡那霉素具有某些耳毒性的因素,影响了卡那霉素对听力的改善作用。卡那霉素耳毒性包括对前庭和耳蜗两部分作用,其中对耳蜗的损害最严重[8]。有研究认为,高浓度的卡那霉素,不论是全身或局部用药,药物均可达到内耳淋巴液,使内耳毛细胞受损[9]。Sha SH等发现,卡那霉素首先损伤Corti氏器的外毛细胞,从耳蜗的底回开始,逐渐向耳蜗顶回发展,随后累及内毛细胞、耳蜗血管纹细胞、支持细胞和螺旋神经节细胞[10]。本研究的耳蜗基底膜形态学结果表明,卡那霉素对耳蜗外毛细胞损伤严重,尤其是第一排外毛细胞,呈现大片缺失,相同部位的纤毛和表皮板也可见缺失,而内毛细胞基本完整,损伤不明显。同时,头孢哌酮钠组内毛细胞和外毛细胞均无损伤,表明头孢哌酮钠无内耳毒性。因此我们推测,由于卡那霉素具有的损伤内耳毛细胞的耳毒性,导致针对化脓性中耳炎治疗时效果不佳。虽然生理盐水组内毛细胞和外毛细胞均无损伤,但生理盐水组听力损失最严重,表明此模型豚鼠的中耳传音结构受到破坏,但没有影响到内耳结构。

本课题在化脓性中耳炎的豚鼠模型上使用卡那霉素和头孢哌酮钠,探讨了不同类型抗生素在豚鼠化脓性中耳炎中的抗炎作用,做到合理使用抗生素。本研究发现,虽然卡那霉素和头孢哌酮钠均有显著的抗金黄色葡萄球菌的作用,但是卡那霉素具有明显的耳毒性,因此在治疗金黄色葡萄球菌引起的化脓性中耳炎时,推荐使用头孢哌酮钠。

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