注射用阿洛西林钠无菌检查方法验证实验

陈慧 邱旭

注射用阿洛西林钠无菌检查方法验证实验

陈慧 邱旭

目的建立健全注射用阿洛西林钠无菌检查方法,保证检验结果的准确性和可靠性。方法按中国药典 2010年版二部(附录ⅪH)无菌检查法中的薄膜过滤法进行。结果采用薄膜过滤法以 500ml/管缓冲液冲洗量检查,阿洛西林钠对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。结论注射用阿洛西林钠采用薄膜过滤法进行无菌检查时,缓冲液冲洗量以 500ml为宜,金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均可作为阳性对照菌。该方法可作为注射用阿洛西林钠的常规无菌检查方法。

注射用阿洛西林钠;无菌检查法;方法学验证

阿西洛林钠是青霉素类抗生素,第三代广谱半合成青霉素,对G+菌、G-菌及厌氧菌有效,能强烈地对抗绿脓杆菌。临床应用于 G+菌、G-菌及厌氧菌引起的感染。本实验采用中国药典 2010年版无菌检查中的薄膜过滤法,探寻注射用阿洛西林钠无菌检查时适宜的检验方法。

1 试验环境与材料

1.1 试验环境 在环境洁净度万级、局部洁净度百级的单向流空气的菌无室中进行。

1.2 仪器 智能集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)、PY 330一次性全封闭集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司)、生化培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)、霉菌培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)、生物安全柜(苏州安泰空气技术公司)

1.3 试药 注射用阿洛西林钠(华北制药股份有限公司、规格 1.5g、批号:F1003603)

1.4 试验用菌株 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

1.5 培养基、稀释液及缓冲液

1.5.1 干粉培养基 硫乙醇酸盐流体培养基(批号:100318)、改良马丁培养基(批号:091019)、营养琼脂培养基(091221)、琼脂粉(000817),均由北京三药科技开发公司生产。

1.5.2 细菌稀释液 0.9%灭菌氯化钠溶液(批号:2010041103)由洛阳市秦岭制药有限责任公司生产。

1.5.3 冲洗用缓冲液 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号:20110305),由三门峡市食品药品检验所药理室配置。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 按中国药典 2010年版附录ⅪH无菌检查法菌液制备方法制备[1]。

2.2 菌落计数 取金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液各1m l分别接种于营养琼脂培养基中,生孢梭菌接种至含 1.5%琼脂的硫乙醇酸盐流体培养基中,经30℃～35℃生化培养箱培养 24～48h,取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各 1m l分别接种至改良马丁琼脂培养基中,经23℃～28℃霉菌培养箱培养 48～72h,计数。结果见表1。(上述各菌液分别接种两个平板,取平均值,同时设阴性对照)

表1 验证用菌液的稀释级及菌落数

2.2 方法学验证

2.3.1 试验组(样品 +阳性) 取一次性全封闭集菌培养器(三联装)一套,先用少量 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜,取样品 15瓶溶解于 250m l缓冲液中,按薄膜过滤法过滤,样品过滤完毕后,再用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗,每次每管注入冲洗液 100ml,充分振摇,完全排空后循环操作 3次,总冲洗量达到 300ml每管。冲洗完毕后在2管中分别注入改良马丁培养基 100ml,另 1管中注入硫乙醇酸盐流体培养基 100m l。另取一套集菌培养器(三联装)取本品依上述方法过滤并冲洗后,均注入硫乙醇酸盐流体培养基 100ml,将上述 6管集菌培养器移至阳性对照室,于含硫乙醇酸盐流体培养基的集菌培养器中,分别接种金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液、生孢梭菌菌液各 1ml,于含改良马丁培养基的集菌培养器中,分别接种白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各 1m l,按前述规定温度培养 3～5d,观察结果(见表2)。

2.3.2 阳性对照组 取一次性全封闭集菌培养器(三联装)二套,4管中分别注入硫乙醇酸盐流体培养基各 100ml、2管中分别注入改良马丁培养基各 100ml,在阳性对照室内将 6种菌液分别接种至相应管内,作为阳性对照,按前述规定温度培养 3～5d,观察结果(见表2)。

2.3.3 阴性对照组 取一次性全封闭集菌培养器(二联装)一套,滤过适量缓冲液后分别注入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各 100ml,作为阴性对照,按前述规定温度培养 14d,观察结果(见表2)。

表2 方法学验证结果统计表

以上 3组平行试验结果表明,本品在该检验量下用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以 300ml/管的冲洗量冲洗,枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌及黑曲霉管中仅需2d就发现有菌生长,而金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌管中 4d后才发现有菌生长,说明在该冲洗量下上述 2种菌的抑菌活性尚不能完全消除。因此将冲洗量增加为 500ml/管、800m l/管,同法操作,验证结果(见表3)。

表3 方法学验证结果统计表

综合表3结果可以看出,在冲洗量为 500ml/管的条件下,对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除,在冲洗量为 800ml/管的条件下,滤膜由轻微的破裂,导致试验失败,无法统计结果。

由此可以得出,本品采用薄膜过滤法进行无菌检查时,缓冲液的冲洗量以 500ml为最佳选择。

2.3.4 样品的无菌检查 取样品 15支依上述方法同法操作,以 500ml/管的冲洗量冲洗,加入培养基后,按规定温度培养 14d,逐日观察,样品组 2管均澄清;阳性对照管培养 2d后,菌落生长良好;阴性对照管培养 14d均澄清;由此判定供试品符合规定。

3 讨论

目前,抗生素类药物的应用非常广泛,针对每种抗生素类药物建立严格的质量标准,提高抗生素的质量就显得尤为关键。所以对一个新品种建立无菌检查法时,对其方法进行验证就显得尤为必要。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法,具有准确、方便、快捷的优点,是无菌检查时所采用的一种重要方法。

试验表明上述方法操作方便快捷、结果准确。所以,该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

[1] 中国药典委员会.中国药典 2010年版.二部.北京:中国医药科技出版社,2010.

450002三门峡市食品药品检验所