颗粒状角膜营养不良一家系BIGH3基因突变的研究

侯志强，王薇，张晶，许永根，周臻，黄琛，2

（北京大学第三医院 1.眼科；2.中心实验室，北京 100191）

颗粒状角膜营养不良一家系BIGH3基因突变的研究

侯志强1，王薇1，张晶1，许永根1，周臻1，黄琛1，2

（北京大学第三医院 1.眼科；2.中心实验室，北京 100191）

目的对1个颗粒状角膜营养不良家系进行分子遗传学分析，探讨其BIGH3基因突变的类型。方法 收集1个颗粒状角膜营养不良家系中2名患者和1名正常成员的外周血5ml，提取白细胞DNA，利用合成的BIGH3基因第4、11和12外显子的特异性引物，进行PCR扩增，并对PCR产物直接行DNA测序分析。结果 该家系患者成员的BIGH3基因第4外显子存在CGC>CAC（R124H）突变杂合子，而家系表现正常成员无此基因位点突变。结论该颗粒状角膜营养不良家系存在BIGH3基因突变，为R124H杂合突变类型，确诊为Avellino角膜营养不良。

角膜营养不良；BIGH3基因；突变；杂合子

角膜营养不良是一组与遗传有关的原发性、具有病理学组织特性的疾病。裂隙灯下可见角膜前弹力层下面包屑样混浊，随着年龄增长混浊可变为盘状，混浊间及角膜周边部保持清亮［1］。随着分子遗传学研究的深入，已发现该病有关的多个致病基因［2，3］，其中，BIGH3基因突变与多种类型的角膜营养不良有关。现已发现，颗粒状角膜营养不良（granular corneal dystrophy，GCD）Ⅰ型中 BIGH3基因突变位点为 R555W［4］，GCDⅡ型（即 Avellino角膜营养不良）为 R124H［5，6］，GCD Ⅲ型为 R124L［7］、R555Q［4］和 G623D［8］，均为常染色体显性遗传。本研究对 1个GCD家系进行了分子遗传学研究，并对该家系中的2名患者和1名正常成员进行了系统的临床和基因分析，以明确该家系是否存在BIGH3基因突变及突变类型，旨在探讨分子遗传学在角膜营养不良临床诊断中的应用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

对1个GCD家系中2名患者和1名正常成员进行分析。该家系来自北京大学第三医院眼科，2代3人，其中患病者2人，均为男性。详细询问病史、行裂隙灯显微镜检查及眼前段照相。

该GCD家系呈常染色体显性遗传，其家系谱见图1。家系中2例患者中先证者表现为双眼对称性中央部角膜基质层散在大量的环状、盘状、星状和不规则形状的混浊，边缘清晰，同时混浊间角膜和周边部角膜透明。而患者I-1右眼角膜清亮无混浊，左眼仅见下方角膜1个斑点状混浊，边界清晰。角膜混浊形态见图2。

1.2 BIGH3基因突变检测

1.2.1 试剂和仪器：血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR Master Mix（2X）购自 Fermentas公司，DL2000TMDNA Marker购自大连宝生物公司，UltraPureTMAgarose和Ultra－PureTMDNA Typing Grade誖 50X TAE Buffer购自 In－vitrogen公司。

1.2.2 基因组DNA提取：在获得被采血人书面签字同意后，抽取2名患者和1名家系正常成员的外周血5ml，置于EDTA-K3抗凝的真空采血管中，按血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。

1.2.3 聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR）扩增：合成BIGH3基因第4，11和12外显子PCR特异性引物各1对（北京擎科生物技术有限公司），引物序列、解链温度（Tm）和PCR产物片段长度见表1。采用PCR Master Mix（2X）进行BIGH3基因第4、11和12外显子序列PCR扩增。反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，Tm 45s，72℃ 1min20s，30个循环；72℃10min。

1.2.5 PCR产物测序：PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测特异性后，送北京擎科生物技术有限公司，应用ABI377自动测序仪进行测序。

2 结果

该GCD家系的全部患者均扩增出特异性条带。第4，11和12外显子PCR产物长度分别为442bp，374bp，475bp。所有PCR产物均进行正反双向测序，反向序列结果与正向序列结果相符，再将DNA测序结果与GenBank中BIGH3基因原始序列进行序列比对，结果如下：

表1 BIGH3基因第4、11和12外显子PCR特异性引物信息及产物长度Tab.1 Primers and product length of exons 4，11，and 12ofBIGH3gene Exon Primer sequence Tm（℃） PCR product（bp）4 F 5′-CCTCTCCACCTGTAGATGTACC-3′ 52 442R 5′-GACGCAACCTGGTAAGACAT-3′11 F 5′-CCTCGTGGAAGTATAACCAGTC-3′ 51 374R 5′-CCAATGTAAGCTTTCAAGGC-3′12 F 5′-GAGAGCTGGAGCCTGGAATC-3′ 56 475R 5′-GCTAGTTCCTTTAGTCCCGCC-3′Tm，melting temperature.

2.1 R124H（CGC>CAC）突变

BIGH3基因第4外显子编码区段的124密码子的正常序列为纯合CGC（图3A），编码精氨酸。如图3B和表2所示，该家系2名患者均检测到基因突变，为R124H突变杂合子（CGC>CAC），编码组氨酸，其外显率为100%。而正常成员无该位点突变。

2.2 同义单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP）

BIGH3基因第11外显子编码区段的472密码子的正常序列为CTC（图3C），可存在CTT的SNP，编码亮氨酸。患者存在CTC>CTT的同义SNP（图3D，表2），为杂合型。正常成员无该位点同义SNP存在。BIGH3基因第12外显子编码区段的540密码子的正常序列为TTT（图3E），可存在TTC的同义SNP，编码苯丙氨酸。患者Ⅰ-1和Ⅱ-1存在TTT>TTC的SNP（图3F，表2），为杂合型。家系正常成员I-2无该位点同义SNP。

表2 颗粒状角膜营养不良家系的BIGH3基因突变和同义SNP Tab.2 Mutation and SNP ofBIGH3gene in a family with granular corneal dystrophy BIGH3gene mutation and SNP R124H（CGC>CAC） L472L（CTC>CTT） F540F（TTT>TTC）Ⅰ-1 ＋ ＋ ＋Ⅰ-2* － － －Ⅱ-1 ＋ ＋ ＋*normal phenotype；＋，presence；－，absence.Patient No.

2.3 以分子遗传学为基础的临床诊断

对照各类GCD所存在的BIGH3基因突变类型，诊断该家系应为Avellino角膜营养不良。

3 讨论

GCD作为最常见的一种角膜实质部营养不良，临床上分为 3型［1］：GCD I型：儿童期发病，裂隙灯检查发现在前弹力层下有呈面包屑样混浊，随着年龄增长，混浊可以扩大为盘状，但混浊间及角膜周边部保持清亮。电镜下可见细胞外的沉积物富含蛋白质；GCDⅡ型：即Avellino角膜营养不良，裂隙灯下可见角膜基质内环状、盘状、星形、雪花状混浊。病理检查发现，角膜基质中有圆点状结晶体聚集，并有淀粉样物质存在；GCDⅢ型：即Reis-bucklers角膜营养不良、Bowman层营养不良型、地图状角膜营养不良。其典型临床表现为混浊仅限于上皮层或上皮下，圆点状混浊位于前弹力层和上皮下，位置表浅的环形和盘状混浊，逐渐发展为中央环形或地图状，有时在深部基质可存在卫星灶。裂隙灯检查提示本研究中的角膜营养不良患者的角膜混浊部位及形态符合颗粒状角膜营养不良。但患者Ⅰ-1的右眼未见有混浊病灶，同时其左眼也仅有1个斑点状混浊病灶。混浊严重程度明显小于患者Ⅱ-1。

BIGH3基因是第一个被确定的角膜营养不良的致病基因，其编码的KE蛋白包含1个氨基端的分泌性前导肽信号序列，1个羧基末端的RGD序列（Arg-Gly-Asp）和中间4个由140个氨基酸组成的内部重复同源序列（fasc1～4）。近年的研究结果显示，该致病基因主要影响KE蛋白的氨基酸R124和fasc-4区域［4］。本研究发现，该角膜营养不良家系中患者的BIGH3基因突变类型为R124H杂合突变，而家系中正常表型成员不存在该位点突变。根据遗传学研究结果，可将本家系角膜营养不良确诊为Avellino角膜营养不良（即GCDⅡ型），其致病的突变位点为BIGH3基因的R124H。

本研究还发现，该家系成员中存在两个位点的同义SNP，即第11外显子编码区段的472密码子CTC>CTT和第12外显子编码区段的540密码子TTT>TTC。同义SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同，因此对KE蛋白的表达和功能无影响。提示该家系主要致病因素为BIGH3基因的R124H杂合突变。

BIGH3基因相关性角膜营养不良表现为发病年龄越早，病情越严重，其严重程度与突变基因的纯合或杂合状态有关［9］。纯合子患者临床特点包括：（1）近亲婚配的后代；（2）发病早，进展快，早期接受角膜移植手术；（3）术后1年内复发；（4）角膜沉积物数量多于杂合子。本研究中患者I-1的右眼未见有混浊病灶，同时其左眼也仅有1个斑点状混浊病灶。患者Ⅰ-1的角膜混浊严重程度也很轻。该家系的分子遗传学检测提示为BIGH3基因的R124H杂合突变，提示突变基因对表现型严重程度的影响具有剂量效应。

总之，分子遗传学研究为临床提供了新的分类分型方法，应用该方法对角膜营养不良进行分类和分型，使临床诊断的准确性得到极大的提高，拥有传统的眼科常规检查法所不可比拟的优势。同时，也使遗传咨询成为可能，为最终实现角膜营养不良的基因治疗提供基础。

［1］Williams TD，Lyle WM.Granular corneal dystrophy：slitlamp biomicroscopic appearances in three generations of patients ［J］.Optom Vis Sci，2001，78（2）：79－84.

［2］Klintworth GK.Advances in the molecular genetics of corneal dystrophies［J］.Am J Ophthalmol，1993，128（6）：747－754.

［3］Kim HS，Yoon SK，Cho BJ，et al.BIGH3gene mutations and rapid detection in Korean patients with corneal dystrophy ［J］.Cornea，2001，20（8）：844－849.

［4］Kocak-Altintas AG，Kocak-Midillioglu I，Akarsu AN，et al.BIGH3gene analysis in the differential diagnosis of corneal dystrophies［J］.Cornea，2001，20（1）：64－68.

［5］Munier FL，Korvatska E，Djema觙A，et al.Kerato-epithelin mutations in four 5q31-linked corneal dystrophies ［J］.Nat Genet，1997，15（3）：247－251.

［6］DiaperCJ，SchorderetDF，ChaubertP，etal.Clinicalandimmunopathological corneal phenotype in homozygotes for the BIGH3R124H mutation［J］.Eye（Lond），2005，19（1）：92－96.

［7］Dighiero P，Drunat S，D'Hermies F，et al.A novel variant of granular corneal dystrophy caused by association of 2mutations in the TGFBI gene-R124L and DeltaT125-DeltaE126［J］.Arch Ophthalmol，2000，118（6）：814－818.

［8］Afshari NA，Mullally JE，Afshari MA，et al.Survey of patients with granular，lattice，avellino，and Reis-Bücklers corneal dystrophies for mutations in the BIGH3and gelsolin genes ［J］.Arch Ophthalmol，2001，119（1）：16－22.

［9］Mashima Y，Konishi M，Nakamura Y，et al.Severe form of juvenile corneal stromal dystrophy with homozygous R124H mutation in the keratoepithelin gene in five Japanese patients ［J］.Br J Ophthal，1998，82（11）：12802－12804.

（编辑王又冬，英文编辑陈 姜）

Analysis ofBIGH3Gene Mutation in a Chinese Family with Granular Corneal Dystrophy

HOU Zhi-qiang1，WANG Wei1，ZHANG Jing1，XU Yong-gen1，ZHOU Zhen1，HUANG Chen1，2
（1.Department of Ophthalmology；2.Central Laboratory，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China）

ObjectiveTo detect the mutation ofBIGH3gene in a Chinese family with granular corneal dystrophy and identify the type of mutation.MethodsPeripheral blood was sampled from 2patients and 1unaffected family member from a family with corneal dystrophy.DNA in the leukocytes was extracted.Exons 4，11，and 12ofBIGH3gene were amplified by polymerase chain reaction，and the products were sequenced directly.ResultsDirect sequencing of all affected members revealed a G to A transition at codon 124（CGC to CAC），resulting in R124H mutation ofBIGH3gene.ConclusionR124H mutation ofBIGH3gene is detected in a Chinese family with granular corneal dystrophy，and the definite diagnosis is Avellino corneal dystrophy.

corneal dystrophies；BIGH3gene；mutation；heterozygote

R772.2

A

0258-4646（2011）03-0246-04

doiCNKI：21-1227/R.20110328.1517.017

北京市科学技术委员会资助项目（D206009000091）

侯志强（1973-），男，主治医师，博士.

黄琛，E-mail：candyhuang719@hotmail.com

2010-12-24