不同批次华蟾素注射液对肝功能的影响Δ

周 昕，谢瑞芳，杨金坤，高 峰，顾希钧(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

华蟾素注射液(cinobufacini injection)是中华大蟾蜍皮经提取加工制成的水溶性制剂，主要含有5-羟色胺、蟾蜍色胺等吲哚类生物碱、蟾毒灵(buffalin)、脂蟾毒配基(resibufogenin)、华蟾酥毒基(cinobufagin)等内酯类、甾族化合物以及氨基酸等成分［1］，具有清热解毒、消肿止痛、活血化瘀、软坚散结的作用。临床上多用于慢性乙型肝炎、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、白血病等症，尤其对原发性肝癌［2］及中晚期肺癌［3］效果显著，联合放化疗和介入治疗能明显提高放化疗的临床疗效，减轻放化疗的不良反应［4，5］，能够使癌痛得到有效控制，改善患者生活质量。

近年来上海中医药大学附属龙华医院常应用中药注射液作为肿瘤治疗的辅助用药［6］，其中华蟾素注射液常常用于原发性肝癌的治疗，经辨证适用于癌毒热盛者，每月连续静脉滴注10 d为1个周期，3个月为1个疗程，取得了良好的临床效果，已经列入肿瘤科的诊疗常规。

为了更好地控制质量，本课题比较不同批次之间华蟾素注射液有效成分的含量，并与临床应用情况相结合，探讨质量控制与临床疗效的关系，为控制产品质量以及临床用药提供依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

华蟾酥毒基 (中国药品生物制品检定所)、酯蟾毒配基(中国药品生物制品检定所)、5-羟色胺(中国药品生物制品检定所)、4-(对二甲氨基)苯甲醛 (国药集团化学试剂有限公司，批号:F20080129)、蟾蜍噻咛(安徽金蟾生化股份有限公司)、华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批号:080506、080904、090322)。

1.2 实验仪器

Agilent高效液相色谱仪、Agilent1100自动进样器(二极管阵列检测器)、SHIMADZU UV-2450型紫外分光光度计、YB-2型澄明度检测仪(天津大学精密仪器厂)、pH S-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 5-HT的测定

2.1.1 对照品的配制:称取5-HT对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为0.04 mg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.1.2 15%对二甲氨基苯甲醛溶液的配制:称取4-(对二甲氨基)苯甲醛适量，用盐酸(2→3)溶解，即得。

2.1.3 样品溶液的制备:取不同批号的华蟾素注射液5 mL，置10 mL量瓶中，加15%对二甲氨基苯甲醛溶液(临用新配)定容至刻度，反应30 min，备用。

2.1.4 空白溶液的制备:取蒸馏水5 mL，置10 mL量瓶中，按样品溶液的制备方法操作。

2.1.5 测定波长的确定:取配制好的对照品溶液4 mL加水至5 mL，置10 mL量瓶中，按样品溶液的制备方法操作。以空白溶液为对照，在190～900 nm波长范围内进行扫描，扫描结果见图1，最终确定测定波长为559 nm。

图1 华蟾素注射液5-HT的紫外扫描图谱Fig 1 UV scanning spectra of 5-HT of cinobufacini injections

2.1.6 标准曲线的绘制:精密吸取上述配制好的对照品溶液，稀释至不同浓度，按照上述方法进行操作并测定。以浓度(X)为横坐标，以吸收度(Y)为纵坐标，得到的标准曲线为Y=30.559X+0.027(r=0.999 6)，线性关系良好。

2.1.7 精密度:取浓度为6 μg·mL-1的对照品溶液，连续进样6次，计算RSD=0.325%，精密度良好，见表1。

2.1.8 重现性:取华蟾素注射液(批号:080506-2)6份，按照样品制备方法进行操作，测定吸收度，计算RSD=1.48%，重现性良好，见表1。

2.1.9 稳定性:取样品溶液(批号:080607-1)分别在 0、10、30、60、90、120 min 测定吸收度，计算 RSD=3.00% ，稳定性良好，见表1。

表1 5-HT精密度、重现性及稳定性试验(n=6)Tab 1 Precision，reproducibility and stability tests of 5-HT(n=6)

表2 样品5-HT的含量测定Tab 2 Determination of the content of 5-HT in sample

2.1.10 样品吸收度的测定:取上述制备好的不同批号的样品溶液，在559 nm下进行测定，测定结果见表2，可见批次之间含量有一定差异，RSD＜7%。

2.2 蟾蜍噻咛的测定

2.2.1 色谱条件:流动相为乙腈∶水 =6∶94，流速为1 mL·min-1，检测波长为225 nm，检测温度为25℃，进样量为5 μL。在上述色谱条件下，样品中蟾蜍噻咛色谱峰与其他杂质峰能达到基线分离，保留时间为11.3 min，出峰时间较合适，见图 2、图 3。

图2 蟾蜍噻咛对照品色谱图Fig 2 Chromatogram of the reference substance of bufothionine

图3 华蟾素注射液的色谱图Fig 3 Chromatogram of cinobufacini injections

2.2.2 对照品溶液的配制:精密称取蟾蜍噻咛对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为0.04 mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3 样品溶液的制备:取华蟾素注射液1支，1万转/min离心10 min，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.2.4 标准曲线的绘制:将上述配制好的对照品溶液，稀释至不同浓度，进样。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到标准曲线为 Y=14 328X-0.937 3(r=0.999 7)，具有良好的线性关系。

2.2.5 精密度:精密吸取上述配制的对照品溶液，连续进样6次，测峰面积。RSD=1.24%，精密度良好，见表3。

表3 精密度考察(n=6)Tab 3 Precision test(n=6)

2.2.6 回收率:精密称取9份，分3组，按照样品含量的80%、100%、120%分别加入对照品溶液，按照2.2.3项下样品溶液的制备方法操作，得到的样品溶液，进样，测峰面积。回收率在9% ～101%之间，RSD＜8%，回收率良好，见表4。

2.2.7 样品含量:取不同批号的华蟾素注射液1支，1万转/min离心 10 min，取上清液，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取3 μL注入高效液相色谱仪测定。结果表明，不同批次之间的含量还是有一定差异的，RSD小于7%，见表5。

2.3 临床疗效分析

2.3.1 一般资料及对象:22例病例均来自2008年8月—2009年6月上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科收治的住院患者，无手术、放疗及化疗指征的晚期肝癌患者，主要给予中医药治疗;对于中医辨证为热毒盛的患者，给予华蟾素注射液静脉滴注。3个不同批号的注射液，随机给予患者，医院药房进行药物准备，统一编号。

2.3.2 研究方案:(1)给药方法:临床上对于原发性肝癌辨证属热毒盛的患者给予华蟾素注射液静脉滴注，1次4支，每月连续静脉滴注10 d为1个周期。(2)合并用药要求:试验期间所有的合并用药(包括基础治疗药物)均应详细记录，包括药物名称、每日总剂量、使用原因、开始日期、中止日期或末次就诊时仍在使用等。(3)试验开始前已存在的合并疾病或症状(指本病以外的症状)亦应详细记录。试验开始后出现的任何合并疾病，应被视为不良事件而记录在“不良事件”表中。(4)疗程:10 d静脉给药为1个疗程，并在治疗前及治疗结束后进行实验室检查。(5)主要观察指标:①安全性检测指标:一般体检项目，包括体温、呼吸、心率、血压以及其他可能出现的任何不良反应;②疗效性检测指标:肝脏情况为治疗前后肝功能指标，包括总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比例、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸/丙氨酸、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、胆碱脂酶(CHE)、总胆红素(TB)、结合胆红素(考虑指标的选择应该照顾到药毒性指标和肝功能储备指标2个方面)，检查频次:每次住院和观察结束时各复查1次血常规和肝功能(包括凝血酶原时间)。(6)有效性和安全性的评价:①疗效评价:比较治疗前后主要肝功能的变化。②安全性评价标准分3级，分别为1级:安全，无任何不良反应，安全性指标检查无异常;2级:比较安全，有轻度不良反应，不需做任何处理可继续给药，安全性指标检查无异常;3级:有安全性问题，有中等程度的不良反应，或安全性指标检查有轻度异常，做处理后可继续给药;4级:因严重不良反应中止试验，或安全性指标检查明显异常。(7)意外情况处理方案，参见《药品临床试验管理规范(GCP)》相关规定。(8)中止、撤出标准，参见《药品临床试验管理规范(GCP)》相关规定。(9)数据统计分析:采用SPSS 11.5统计软件进行统计 。描述性统计分析:肝功能指标以均数±标准差描述。组对比分析:计量资料服从正态分布时，组内治疗前后比较用配对 t检验，组间比较用成组t检验(组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用 Satterthwaite方法进行纠正的t检验)，组间比较若考虑协变量的影响用协方差分析(Analysis of covariance);若不符和正态分布用Wilcoxon秩和检验及Wilcoxon符号秩和检验。不同批次对肝功能的影响用单因素方差分析。

表4 蟾蜍噻咛回收率试验(n=3)Tab 4 Recovery test of bufothionine(n=3)

表5 样品中蟾蜍噻咛含量测定Tab 5 Determination of the content of bufothionine in sample

2.3.3 结果:从治疗前患者的肝功能情况看，各项指标经方差分析3个批次没有显著性差异，说明入组患者具有可比性。从值可知，白球比例、胆碱脂酶偏低，球蛋白、谷草转氨酶、谷草/谷丙、r-转肽酶、乳酸脱氢酶、总胆红素、结合胆红素偏高，说明肝癌患者肝功能均有一定损伤。从治疗前后患者的肝功能情况看，虽然肝功能统计没有显著性差异，但从趋势上看，各项肝功能指标向好的方向发展。通过单因素方差分析对3个批次的华蟾素注射液治疗前后肝功能指标的差值进行统计，3个批次没有显著差异，见表6。在收集的病历中，均无明显的关于华蟾素注射液的不良反应发生。

表6 3个批次治疗前后肝功能指标变化Tab 6 Changes in liver functional parameters before and after treatment with 3 batches of cinobufacini injections

3 讨论

本课题先按照厂家的质控方法［7］对华蟾素注射液中吲哚生物碱进行了测定，发现该方法简便快速(见表2、图1)，但专属性不强，所以考虑对某单一化合物进行检测。起初按照文献［1］采用高效液相方法以及液质联用的方法测定华蟾素注射液中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等脂溶性成分的含量，但没有成功，后采用液相色谱的方法测定水溶性成分蟾蜍噻咛的含量。方法学研究表明，该方法线性、精密度、回收率均良好(见表3、表4、图2、图3)。分析原因可能是，华蟾素注射液是水溶性制剂，在提取分离纯化的过程中，脂溶性成分大部分都除去了，因此无法测定到。故本课题选择5-HT和水溶性成分蟾蜍噻咛作为含量测定的指标成分。

通过对不同批华蟾素注射液的吲哚总生物碱以及蟾蜍噻咛的含量研究，可知不同批次成分含量确实存在一定差异，但差异不大，RSD在14% 以下(见表2、表5)。分析原因可能是，由于注射液的原料是野生蟾蜍，无法保护原料品质绝对一致，但如果大量养殖，又可能导致种属质量下降，所以需要一些试验来研究是否这些差异会作用不同。

从不同批次注射液对肝癌患者的肝功能指标的影响可知，使用注射液以后没有显著性差异，这就说明了可以较放心使用，至少批次疗效是相对稳定的(见表6)。

在本课题的实施当中，没有发现明显的不良反应，这也可能与在实验开始的早期，临床药师把厂方提供的关于正确使用华蟾素注射液方法告知医护人员有关。

［1］苏永华，黄雪强，张大志，等.华蟾素注射液中蟾毒内酯类成分的含量检测［J］.中成药，2003，25(1):24.

［2］王 昕，苑凤芹.华蟾素治疗原发性肝癌的临床疗效观察［J］.实用中医内科杂志，2005，19(4):379.

［3］邵国荣.华蟾素注射液治疗中晚期肺癌33例临床观察［J］.天津中医，2001，18(3):46.

［4］陈燕平，刘秀娟.华蟾素注射液配合化疗治疗晚期恶性肿瘤临床观察［J］.实用中西医结合临床，2003，3(2):18.

［5］周 昕，杨金坤，朱玲琦，等.华蟾素注射液应用于介入治疗肝癌的 Meta分析［J］.中国新药与临床杂志，2009，28(9):671.

［6］周 昕，谢瑞芳，顾希钧，等.我院近三年与肿瘤相关的中药注射剂用药分析［J］.中国医院用药评价与分析，2008，8(12):889.

［7］丁秀年，张群林，张 艳.分光光度法测定华蟾素分散片中吲哚类生物碱的含量［J］.安徽医药，2007，11(12):1093.