缺氧诱导因子-1α、E-选择素及其配体的动态表达对肝癌的临床评价价值

李忠斌 ，吴 欣 ，宫 嫚 ，罗生强

1.解放军第三〇二医院肝纤维化无创诊疗中心，北京 100039；2.解放军第三〇二医院中西医结合肝病诊疗与研究中心，北京 100039

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生发展是一个多基因、多诱因、多阶段的过程，随着癌细胞的增殖，耗氧量增加，导致癌组织严重缺氧。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧状态下广泛存在于多种肿瘤细胞中的一种关键性转录调控因子，在缺氧环境中表达显著增加，激活缺氧反应性基因表达，与癌细胞的能量代谢、血管生成、增殖和转移、耐受放化疗和预后等密切相关[1]。另外，在癌细胞侵袭转移过程中存在细胞黏附分子及其介导的黏附行为的改变，E-选择素（E-selectin）是黏附分子选择素家族中重要的一员，E-选择素及其配体唾液酸化路易斯寡糖-X（sialvl lewis-X，sLeX）在HCC癌细胞侵袭转移中具有重要作用[2]。笔者应用免疫组化技术检测了部分肝细胞癌及正常肝组织标本中HIF-1α、E-选择素与配体sLeX的表达，探讨了其对肝癌的临床评价价值，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2005年1～12月肝癌手术切除的癌灶组织标本45份，均经病理学检查证实为肝细胞肝癌，所有患者术前均未接受过化疗、放疗、介入等治疗。45例HCC患者中，男30 例，女 15 例；年龄 33～75 岁，平均（52.6±8.5）岁；TNM 分期为：Ⅰ期2例，Ⅱ期15例，Ⅲ期25例，Ⅵ期3例；细胞分化程度：高度分化13例，中度分化22例，低度分化10例。全部受试患者均有完整的病历资料、病理诊断和随访资料，另随机选择45份正常肝组织标本作为对照组。

1.2 方法

将石蜡包埋的癌灶组织、正常肝组织标本制成5 μm厚的石蜡切片，常规处理，免疫组化采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法（SP），兔抗人HIF-1α抗体购自武汉博士德公司，鼠抗人E-选择素单抗购自法国IMMUNOTECH公司，鼠抗人sLeX单抗购自日本Aichi肿瘤中心，SP试剂盒购于福州迈新生物技术公司，免疫组化按说明书进行实验操作，同时设置阴性及阳性对照。

1.3 结果判读

参考董志珍等[3]标准进行HIF-1α结果判读：HIF-1α主要位于细胞质中，部分胞核中亦有表达；以细胞呈均匀一致清晰棕黄色为阳性，按阳性细胞所占比例分为：① 阴性（-）：阳性细胞数<10%；②弱阳性（+）：阳性细胞数占10%～25%；③中等阳性（++）：阳性细胞数占 26%～50%；④强阳性（+++）：阳性细胞数>50%。参考钱世鲲等[4]标准进行E-选择素、sLeX结果判断：E-选择素表达特征为癌灶边缘血管内皮细胞出现棕黄色染色，sLeX的表达为肝癌细胞出现棕黄色染色；随机选取5个视野，在400×显微镜下观察，染色阳性细胞数>5%为阳性，染色阳性细胞数≤5%为阴性。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料用（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验，半定量等级资料比较采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α、E-选择素、sLeX在肝癌与正常肝组织中的表达

表1 肝癌及正常肝组织中缺氧诱导因子-1α、E-选择素、唾液酸化路易斯寡糖-X表达情况[n(%)]

2.2 肝癌高、中低分化组中HIF-1α、E-选择素、sLeX的表达

HIF-1α、E-选择素、sLeX在肝癌高、中低分化组中的表达情况如表2所示，高度分化组HIF-1α的阳性表达率为23.08%，中低分化组HIF-1α的阳性表达率为87.50%，两组比较差异有统计学意义（χ2=15.02，P＜0.01）。 E-选择素、sLeX在高、中低分化组中的阳性表达比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；HIF-1α、E-选择素、sLeX 与肝癌分化程度呈负相关（rH=-0.46，rE=-0.34，rs=-0.31，P＜0.01 或 P＜0.05）。

2.3 肝癌TNM分期中HIF-1α、E-选择素、sLeX的表达

肝癌TNM分期中HIF-1α、E-选择素、sLeX的表达情况如表3所示，HIF-1α、E-选择素、sLeX与肝癌TNM分期呈正相关性（rH=0.32，rE=0.35，rs=0.36，均 P＜0.05）。

2.4 HIF-1α、E-选择素、sLeX表达与肝癌预后的关系

截至2010年12月，45例肝癌患者中，存活20例，5年存活率为44.45%；死亡25例。HIF-1α、E-选择素、sLeX表达与肝癌预后的关系如表4所示，可见HIF-1α表达为（++～+++）、E-选择素表达为（+）、sLeX 表达为（+）者，其 5 年存活率偏低， 差异有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）；HIF-1α、E-选择素、sLeX 与肝癌预后呈负相关（rH=-0.53，rE=-0.43，rs=-0.36，P＜0.01 或＜0.05）。

肝癌及正常肝组织中HIF-1α、E-选择素、sLeX阳性表达情况如表1所示，肝癌组织中HIF-1α的阳性表达率为68.89%，正常肝组织中HIF-1α的阳性表达率为8.89%，两组比较差异有统计学意义（χ2=34.08，P＜0.01）。肝癌组织中E-选择素、sLeX的阳性表达率分别为66.67%、64.45%，正常肝组织内未见E-选择素、sLeX表达。

表2 肝癌高中低分化组中缺氧诱导因子-1α、E-选择素、唾液酸化路易斯寡糖-X表达情况[n(%)]

表3 肝癌TNM分期中缺氧诱导因子-1α、E-选择素、唾液酸化路易斯寡糖-X的表达情况（例）

表4 缺氧诱导因子-1α、E-选择素、唾液酸化路易斯寡糖-X表达与肝癌预后的关系（例）

3 讨论

随着实质性肿瘤的生长，增大到一定体积时，缺氧是其微环境的基本特征，此时可诱导产生一系列特异性的与血管新生、缺氧代谢密切相关的基因和蛋白，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是肿瘤新生血管生成的主要因素，而VEGF是HIF-1α的主要靶基因，通过激活HIF-1α通路上调VEGF的表达[5]。在正常组织中几乎检测不到HIF-1α，其原因在于HIF-1α在正常氧分压时很不稳定，易被泛素依赖的蛋白水解酶水解[6]。本研究显示，肝癌组织及正常肝组织HIF-1α的阳性表达率分别为68.89%和8.89%，与文献报道结果基本一致。HIF-1α广泛存在于胃癌、肝癌、结肠癌等恶性肿瘤中，并与肿瘤的发生、发展和转移有关。丁磊等[7]研究发现，在肝硬化组织中，以位于肝静脉周围的肝细胞以及肿瘤边缘被压扁的肝组织条索中HIF-1α表达最强，在肝癌中HIF-1α的表达均匀一致，癌旁肝硬化组织的表达均强于肝癌组织，这可能与以下因素有关：①肝组织缺血、缺氧使HIF-1α表达上调，小叶中央静脉周围肝细胞缺氧明显；②组织结构异常、血液动力学紊乱、细胞缺氧微环境；③多种癌基因的失活及癌基因的激活，上调HIF-1α的表达。

在肿瘤的发生发展中，黏附分子具有重要的作用，钱世鲲等[4]认为E-选择素主要作用于早期黏附，通过与炎症反应类似的机制参与肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附，高表达的E-选择素在肿瘤发生发展和转移中具有重要的作用，可作为临床预后和术后早期复发的评估依据之一[8]。

本研究显示，肝癌细胞的分化程度与HIF-1α、E-选择素、sLeX表达具有一定的关系，具体表现为细胞的分化程度低，HIF-1α、E-选择素、sLeX表达阳性程度高，而细胞的分化程度高，HIF-1α、E-选择素、sLeX表达阳性程度低。而HIF-1α、E-选择素、sLeX表达与肝癌TNM分期具有显著的正相关性。在评价肝癌预后方面，HIF-1α、E-选择素、sLeX阳性程度愈高，其预后愈差。综上可见，HIF-1α、E-选择素、sLeX与肝癌的发生、发展、转移与预后具有重要的关系，全面考虑患者的临床资料，结合HIF-1α、E-选择素、sLeX对肝癌患者进行综合评价具有较好的临床应用价值。

[1]李姗姗,姚登福,董志珍.肝缺氧诱导因子-1α与肝癌发生、发展及治疗研究新进展[J].世界华人消化杂志,2010,18(4)：361-367.

[2]张宝华,陈汉,姚晓平,等.E-选择素及其配体sLeX在肝癌转移中的意义[J].中华外科杂志,2000,38(7)：534-536.

[3]董志珍,姚登福,李姗姗,等.肝癌组织缺氧诱导因子-1α的动态表达特征及其临床价值[J].中华肝脏病杂志,2010,18(7)：506-510.

[4]钱世鲲,陈德,李悦,等.E-选择素及其配体表达对肝癌转移的临床意义[J].中华肝脏病杂志,2010,18(6)：440-444.

[5]Copple BL，Bustamanten Welch TP,Kim ND,et al.Hypoxia inducible factor-1α dependent production of profibrotic mediators by hypoxic hepatocytes[J].Liver Int,2009,29：1010-1021.

[6]Semenza GL.Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor-1α [J].Physiology(Bethesda),2009,24：97-106.

[7]丁磊,陈孝平,王海平.缺氧诱导因子-1α蛋白在肝癌组织中的表达及临床意义[J].中华肝脏病杂志,2004,12(11)：656-659.

[8]Song G,Ohashi T,Sakamoto N,et a1.Adhesive force of human hepatoma HepG2 cells to endothelial cells and expression of E-selectin[J].Mol Cell Biomech,2006,3：61-68.