引种互叶白千层茶树油的化学成分及抑菌活性*

钟振声 樊丽妃 黄继兵

(华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640)

互叶白千层茶树原生长于澳大利亚新南威尔士州的北部沿海，其茶树油与世界各地的相比产量最大、质量最佳，目前世界各地多有引种，我国广西、广东、海南等地也有大规模的栽培，其中广西为主要产区［1］.文献报道［2］茶树精油具有广谱抗微生物、抑菌、环保、温和天然清香、无污染无腐蚀、渗透性和生物降解力强的性质.茶树油应用于个人护理品(头发护理、身体护理、洗脚液、肥皂、抗菌型洗手液、口气清新剂及口腔护理用品)、健康用品(急救乳液、杀菌剂、烧伤护理等)中，可起到消炎抑菌、止痛、止痒的作用，现已进入美国食品、药品监督局采购名单.国际上茶树油已广泛应用于医疗、化工等领域，而在中国，茶树油的应用市场还不成熟.我国对茶树油的认识时间较短，目前仅在日化行业有所使用.茶树油的应用作为一个新兴产业，具有良好的开发价值和发展潜力.加强茶树油的基础研究和应用研究，提高我国茶树油的质量，开发茶树油的新产品，具有十分重要的意义.

国内外文献采用气相色谱－质谱联用仪(GC/MS)对茶树油的成分进行分析，发现其主要成分有4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯、1，8-桉叶素等，其主要抑菌活性成分是4-松油醇.居解语等［3］对不同茶树油样品进行了成分差异研究，发现主要是1，8-桉叶素、γ-松油烯、异松油烯和4-松油醇这几种成分含量有较大差异.文中对从澳大利亚引进、经过十年选种培育的广西玉林互叶白千层茶树油进行了化学成分分析及抑菌活性研究，以此来揭示互叶白千层茶树油异地引种后的化学成分及抑菌活性的变化.

1 实验部分

1.1 主要材料与仪器

茶树油，广西玉林市玉州区互叶白千层(澳洲茶树)种植基地提供，茶树引种已十年.大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，取自广州工业微生物检测中心菌种库.无水乙醇、95%乙醇、蔗糖、氯化钠、氢氧化钠，均为分析纯;琼脂、牛肉浸膏、蛋白胨，均为生化试剂.

QP2010型气相色谱－质谱联用仪，日本SHIMADZU公司;SPX-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;XS-212型生物显微镜，南京江南永新光学有限公司;SW-CJ-1D型净化工作台，苏州净化设备有限公司;YX-280D型手提式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司;10mm×7.8mm×(6±0.1)mm型牛津杯，浙江省宁海健民医疗仪器厂.

1.2 实验方法

1.2.1 茶树油理化常数的测定

相对密度依据GB/T 11540—2008测定;折光指数依据GB/T 14454.4—2008测定;旋光度依据GB/T 14454.5—2008测定;闪点依据GB/T 14454.6—2008测定;乙醇中溶解(混)度依据GB/T 14455.3—2008测定.

1.2.2 茶树油的化学成分分析方法

称取一定量茶树油，用正己烷配制成质量浓度约为5mg/mL的样品溶液.采用GC/MS对茶树油进行定性和定量分析［4］.

气相色谱:色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25mm);样口温度为260℃;载气为高纯氦;柱流量为1.0mL/min;分流比为100∶1;进样量为1μL;程序升温起始温度为70℃，速率为2℃/min，终止温度为180℃.质谱:电离方式为EI;电子能量为70eV;接口温度为250℃;离子源温度为200℃;溶剂延迟2 min;加速电压为1.00 kV;扫描范围为45～500 u.

1.2.3 抑菌活性和最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法，用5%(体积分数)的无菌吐温-80溶液将茶树油配成体积分数分别为20%、5%的茶树油溶液［5］.采用牛津杯法［6］测茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，以相同体积分数的溶剂做对比实验.

用混合药剂法［7］测茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球的最小抑菌浓度(MIC).在培养基凝固前加入一定量的茶树油，混合均匀，使培养基中含一定量的茶树油.待培养基凝固后，在培养基表面划线接种细菌，37℃培养24 h后观察细菌生长情况.每一种添加量做3个平行实验，以5%的无菌吐温-80溶液作为对照组.完全无菌生长的茶树油的添加量即为最小抑菌浓度(MIC).

1.2.4 茶树油抑菌活性的稳定性分析

根据文献［8］，在固体培养基凝固前将pH值分别调到 4、5、6、7、8、9、10、11，然后用比各菌的 MIC低一个体积分数梯度的茶树油溶液进行抑菌实验，比较不同pH值下该茶树油溶液的抑菌活性，确定其pH值活性范围(方法同MIC测定).实验中以相应添加量的吐温-80水溶液作对照.

在固体培养基凝固前加入不同质量分数的蔗糖、食盐进行抑菌实验(与pH值影响实验条件相同)，研究蔗糖、食盐对互叶白千层茶树油抑菌活性的影响.以吐温-80水溶液作对照.

2 结果与分析

2.1 茶树油的理化常数

采用国标方法测得的茶树油的相对密度、折光指数、旋光度、闪点及在乙醇中的溶解度如表1所示.

将测得的理化常数与ISO国际标准［8］相比较，发现引种茶树油除了在乙醇中的溶解度符合该标准之外，其余几项常数均不在标准规定的范围之内.这是由于该标准是对4-松油醇型茶树油的规定，而受测茶树油的成分与常规的澳洲茶树油相比，已经有了较大的改变，从而使得其理化常数与国际标准不同，具体见下文的分析.

2.2 茶树油的化学成分

用GC/MS对茶树油进行定量分析，通过图谱(见图1)解析及相关资料查询，将各成分列于表2中.

表1 广西玉林引种互叶白千层茶树油的理化常数Table 1 Physical and chemical constants of tea tree oil from Melaleuca alternifolia planted in Yulin，Guangxi，China

图1 茶树油的总离子流色谱图Fig.1 Total ionic chromatogram of tea tree oil

表2 茶树油化学成分分析结果Table 2 Results of chemical components of tea tree oil

从表2中可知，1，8-桉叶素是广西玉林茶树油的主要成分，相对含量高达72.49%，属于桉型茶树油［7］.一般所说的澳洲茶树油属于4-松油醇型，国际标准ISO规定其4-松油醇的相对含量在30.0% ～48.0%之间，1，8-桉叶素相对含量须小于 15%［9］.广西玉林从澳大利亚引种的互叶白千层茶树通过十年精选培育，不断改良，其茶树油中的1，8-桉叶素相对含量大大增加，而特征成分4-松油醇、α-松油烯、γ-松油烯和异松油烯的相对含量分别降低到不足1%，这说明引种的澳洲茶树极有可能已经发生了变种.

2.3 茶树油的抑菌活性与最小抑菌浓度

选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，研究不同体积分数茶树油的抑菌活性，抑菌圈直径测试结果见表3.由表3中可知，茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑菌活性，即使茶树油体积分数由100%下降到5%，其抑菌活性下降的幅度也不到50%.

表3 不同体积分数茶树油的抑菌效果1)Table 3 Antimicrobial effect of tea tree oil with different volume fractions

一般认为，茶树油的抑菌物质应该是4-松油醇等成分，所以ISO标准中规定4-松油醇的相对含量要高于30.0%.文中所研究的引种茶树油几乎不含4-松油醇，却仍具有强烈的抑菌作用，这说明该茶树油与原种澳大利亚互叶白千层茶树油存在差别，其中起抑菌作用的成分极有可能不是4-松油醇.引种茶树油具体的抑菌成分有待进一步研究.

用混合药剂法测得的茶树油的最小抑菌浓度见表4.由表4可以看出，茶树油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度相同，均为4.00 mL/L，与抑菌圈直径的实验结果相吻合.

2.4 茶树油抑菌活性的稳定性

通常，受测物的抑菌活性会受到pH值、无机盐含量等因素的影响.文中考察了在不同pH值、不同质量分数的食盐或蔗糖存在下茶树油抑菌活性的变化，并对其抑菌活性的稳定性进行评价.

表4 茶树油的最小抑菌浓度测定结果1)Table 4 Measured MICs of tea tree oil

2.4.1 培养基pH值对茶树油抑菌活性的影响

培养基pH值对茶树油抑菌活性影响的实验数据见表5.由表5可以看出，茶树油的抑菌活性具有较宽的pH值范围.在pH=5～10范围内，当茶树油添加量为2.67mL/L时，能较好地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，且随着pH值的升高，抑菌活性先减弱后增强.这是由于培养基的强酸强碱性不利于细菌的生长，再加上茶树油的抑菌作用，两者综合就增强了其抑菌效果.而吐温-80添加量(每升凝胶体系中含有的纯吐温-80的量)为2.67 mL/L的对照样品没有表现出抑菌活性.

表5 培养基pH值对茶树油抑菌活性的影响1)Table 5 Effect of pH value of culture medium on antimicrobial activity of tea tree oil

2.4.2 蔗糖对茶树油抑菌活性的影响

蔗糖对茶树油抑菌活性影响的实验数据见表6.从表6中可以看出，当茶树油添加量为2.67 mL/L时，若蔗糖用量(质量分数，余同)大于5%，则随着蔗糖用量的增大，抑菌效果逐渐加强;蔗糖用量为30%和40%时，完全无菌生长.结果表明，茶树油与蔗糖之间应该存在协同作用.

2.4.3 食盐对茶树油抑菌活性的影响

食盐对茶树油抑菌活性影响的实验数据见表7.从表7中可知，当茶树油添加量为2.67mL/L时，若食盐用量大于2%，则随着食盐用量的增加，培养皿中大肠杆菌的生长程度明显减弱;食盐用量为4%时，大肠杆菌完全受到抑制;而当食盐用量仅为1%时，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果大大增强;当食盐用量为3%以上时，金黄色葡萄球菌完全不生长.这说明食盐和桉型茶树油对金黄色葡萄球菌的协同作用较对大肠杆菌明显.

表6 蔗糖用量对茶树油抑菌活性的影响1)Table 6 Influence of sucrose dosage on antimicrobial activity of tea tree oil

表7 食盐用量对茶树油抑菌活性的影响1)Table 7 Influence of salt dosage on antimicrobial activity of tea tree oil

3 结语

用GC/MS分析得出广西玉林引种茶树油的18种主要化学成分及其相对含量，通过与ISO标准中4-松油醇型茶树油化学成分相对含量的对比，发现广西玉林种植基地的互叶白千层茶树在经过10年的种植以后极有可能已经发生了变异，由4-松油醇型茶树转变为了桉型茶树.茶树虽然可能发生了变异，但其所产的茶树油仍有很强的抑菌活性.文中还发现，桉型茶树油在pH=5～10范围内对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较强的抑制作用，而一定质量分数的食盐及蔗糖与茶树油之间存在明显的协同抑菌作用，这对茶树油的应用有一定的指导意义.

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