不同毒力钩端螺旋体引起THP-1细胞中细胞因子表达的研究

张彦，姜叙诚，郭晓奎，汤道强

1. 上海交通大学医学院病原生物学教研室，上海 200025； 2. 上海交通大学医学院病理学教研室，上海 200025； 3. 上海交通大学医学院附属仁济医院, 上海 200127

钩端螺旋体病(leptospirosis，简称钩体病)是一种由致病性钩端螺旋体(Leptospira，简称钩体)感染引起的常见的、威胁人类健康和畜牧业生产的全球性人畜共患病[1]。自1955年该病被列入法定乙类传染病以来，我国许多地区均有钩体病报告，尤其是在年降雨量多、年平均气温较高的长江流域及其以南省、自治区，钩体病发病率高。

致病性钩体具有很强的侵袭力，带菌动物的尿液污染环境和水源后可通过破损的皮肤或黏膜侵入人体，进入血管后随血流或经淋巴管和组织间隙播散并定植在全身多个脏器，导致钩体病。钩体病的主要临床表现较不典型，常有发热、肌肉酸痛、乏力和眼结膜充血等，严重者可出现黄疸和肝、肾、肺等多脏器广泛出血，引起脏器功能障碍或衰竭而导致死亡。急性重症钩体病的病理形态学特点主要表现为肝、肾、肺等多脏器和黏膜等组织弥漫性出血和轻度炎性反应，发病机制尚不明确[2]。研究发现，不同毒力钩体引起豚鼠体内炎症细胞因子表达水平不同[3]。据报道，钩体糖脂蛋白可诱导人外周血单核细胞释放炎症细胞因子[4,5]，Tajiki等也发现钩体病患者血清中有较高水平的炎症细胞因子[6]。细胞因子在钩体病发病机制中的作用还不清楚，我们通过3种不同毒力钩体与诱导后的人单核巨噬细胞株THP-1相互作用，应用实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素12(interleukin 12，IL-12)和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在基因水平表达的改变，通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测钩体与细胞混合液上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1水平变化；同时应用实时PCR检测细胞表面Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)、TLR4及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)基因表达的改变，比较3株钩体在激活巨噬细胞信号通路中的差异，探讨钩体的致病机制。

1 材料和方法

1.1 材料

问号钩体赖型Lai株来源于四川省钩体病患者，由中国疾病预防控制中心传染病研究所提供。Lai株定期感染豚鼠，然后取发病期豚鼠肝或肾组织在钩体培养基(EMJH)中置28 ℃需氧培养7～14 d，待钩体长出，以此保持其毒力。问号钩体赖型减毒株IPAV株由法国巴斯德研究所Saint-Girons教授和Picardeau博士馈赠。IPAV株是由有毒株Lai株在体外多次传代毒力丧失形成的减毒株，Zhong等已完成其毒力鉴定及基因组和蛋白质组分析[7]。腐生性双曲钩体Patoc型Patoc l株由本研究中心保存。3株钩体均在EMJH培养基中置28 ℃需氧培养至对数期备用。佛波酯(phorbol myristoyl acetate, PMA)购自Sigma公司，SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit购自大连TaKaRa公司，人细胞因子ELISA试剂盒购自R&D公司，ABI 7500 Fast为美国应用生物系统公司产品。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和诱导转化将人单核巨噬细胞株THP-1置含10%胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待细胞生长接近融合时传代，2～3代后的细胞用于实验。调整好细胞浓度后加入终浓度为100 nmol/L的佛波酯, 加入6孔细胞培养板中诱导24～48 h；细胞贴壁转化为巨噬细胞后吸出上清液，再用已灭菌的0.01 mol/L磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次；加入无血清RPMI 1640培养基继续培养24 h，使细胞同步化，然后与钩体相互作用。

1.2.2钩体与细胞的相互作用3株钩体均在EMJH培养基中置28 ℃需氧培养至对数期，暗视野显微镜下计数并计算钩体浓度；4 000g离心20 min，用细胞培养液重悬钩体沉淀物；调整浓度后加入到细胞培养孔中，使细胞与钩体的比例为1∶100，作用0、2、12、24、48 h 后收集细胞与钩体混合液上清液，-80 ℃保存。

1.2.3引物设计针对TLR2、TLR4、iNOS和细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1及β-actin基因设计实时PCR引物(表1)，并通过PCR和熔解曲线检测引物的扩增效果和特异性。

表1Toll样受体和各种细胞因子对应的引物

Tab.1Toll-likereceptorsandprimersofcytokines

CytokineSequence of oligonucleotide (5'-3')Size (bp)TLR2TLR4iNOSTNF-αIFN-γIL-12MCP-1β-actinGATGACTCTACCAGATGCCTCCCCAAATGAAGTTATTGCCACCAGCCGGGTAAGGAATGAGCTAGTAAAGGTGCTGGGACACCACAACAATCCCCAGCCTCAAGTCTTATTTCGCAAGTTCCATCTTTCACCCACGACGTGTACGTGGTAGAGTTGGCCTGGATGGTGAGGGTTTTACCCTGCCCCAATCCCTTTATCCCTAAGCCCCCAATTCTCTTTCAATGGGACGCTCTTTGTAGTCCTTCTTCGTTTCCTCTGGGCAGAAGTGGGTTCAGGATTCCTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTCAGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT1441621791808016190157

1.2.4RNA抽提、纯化和反转录将THP-1细胞沉淀物加入RNA抽提液TRIzol中，振荡均匀后加入三氯甲烷剧烈振荡，室温静置10 min，4 ℃、10 000g离心20 min。取上层水相转移至新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀沉淀，室温放置10 min，4 ℃、12 000g离心10 min。去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀物，离心后保留沉淀物，室温干燥。待沉淀物干燥后，用不含RNase酶的ddH2O溶解RNA并测定浓度。用不含RNase酶的DNase酶消化RNA抽提中残留基因组DNA以防污染，并用酚/氯仿抽提消除蛋白酶对后续实验的影响。

1.2.5实时PCR检测取1 μg纯化的RNA用PrimeScriptTMRT Kit反转录为cDNA。取反转录后的cDNA溶液1 μl，用相对定量法检测TLR2、TLR4、iNOS、TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1及β-actin基因的表达变化。所用荧光染料为SYBE GreenⅠ，计算方法为Ct值比较法，即2- ΔΔCt法，内参基因采用β-actin，用待测细胞因子与0小时对照组相应细胞因子的比值来间接表示THP-1细胞与3株钩体相互作用后上述基因表达的变化。

1.2.6ELISA检测将不同时间点的细胞与钩体混合上清液4 ℃、4 000g离心20 min，取上清液稀释1倍后用人细胞因子ELISA试剂盒双抗夹心法检测TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1的表达水平。步骤如下：将已包被相应抗人细胞因子单克隆抗体的ELISA 96孔板平衡至室温，分别将标准浓度的细胞因子标准品和细胞上清液(100 μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37 ℃孵育90 min，洗板4次，每次3 min。除空白孔外，加入生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗板4次，每次5 min。除空白孔外，每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，37 ℃孵育30 min，洗板4次，每次5 min。然后每孔加入显色剂3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)100 μl，避光37 ℃孵育15 min后，加入叠氮钠终止液，混匀后即刻测量A450值。

1.3 统计学分析

统计学分析软件为SAS 6.0, 统计学分析方法为t检验、方差分析，P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 THP-1细胞中TLR2、TLR4、iNOS的表达改变

钩体与THP-1细胞作用后，细胞中TLR2、TLR4、iNOS基因表达改变见图1。结果显示，Patoc 1株组THP-1细胞中TLR2表达升高，与Lai株和IPAV株组比较有统计学差异(P<0.05)。3株钩体组THP-1细胞中TLR4和iNOS表达皆升高，但IPAV株组TLR4和iNOS表达上调更明显，与Patoc 1株和Lai株组比较有统计学差异(P<0.05)。

A: TLR2. B: TLR4. C: iNOS.*P<0.05 compared with Lai group,#P<0.05 compared with Patoc 1 group. The data are shown as means±SE of the ratio of cytokine to β-actin.

图1不同毒力钩体组THP-1细胞中TLR2、TLR4、iNOS基因表达的改变

Fig.1NormalizedrelativequantificationofmRNAexpressionbyreal-timePCRforTLR2,TLR4andiNOS

2.2 THP-1细胞中TNF-α、 IFN-γ、 IL-12、 MCP-1的表达改变

应用实时 PCR和ELISA分别检测TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1在基因和蛋白水平表达的改变 (图2)。 结果显示， 3 株钩体组THP-1细胞中TNF-α的表达和蛋白分泌皆升高，Patoc 1 株和IPAV株组比Lai株组更明显，有统计学差异(P<0.05)。3株钩体组THP-1细胞中MCP-1基因表达和蛋白分泌增高，虽然在基因水平3株钩体组MCP-1表达有一定差异，但在蛋白水平差异无统计学意义。

A: mRNA levels of TNF-α. B: Protein levels of TNF-α. C: mRNA levels of MCP-1. D: Protein levels of MCP-1.*P<0.05 compared with Lai group,#P<0.05 compared with Patoc 1 group. The data are shown as means±SE of the ratio of cytokine to β-actin.

图2不同毒力钩体组THP-1细胞中TNF-α、MCP-1表达的变化

Fig.2DetectionofTNF-αandMCP-1byreal-timePCRandELISA

3 讨论

致病性钩体可通过破损的皮肤或黏膜侵入人体，进入血管并随血流或组织间隙播散至全身。一般细菌侵入人体后，人体免疫细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)，如TLR、甘露糖受体、清道夫受体等，通过识别细菌病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，其中主要包括脂多糖、磷酸聚糖、脂磷壁酸等，激活免疫细胞，释放细胞因子，直接或间接调节机体的天然免疫和获得性免疫应答[8]。到目前为止，共发现11种TLR，分布在免疫细胞表面及细胞内，通过信号转导蛋白MyD88等传递信号，进一步激活核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，促使IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等表达，激活免疫细胞。其中TLR4主要识别革兰阴性菌的脂多糖、革兰阳性菌的脂磷壁酸等；TLR2主要识别革兰阳性菌的肽聚糖及脂蛋白等。钩体属革兰阴性菌。Yang等发现钩体外膜脂蛋白LipL32通过TLR2激活肾小管上皮细胞NF-κB途径，进而引起其下游基因iNOS、TNF-α、MCP-1表达增高[9]。Werts等也发现致病性问号钩体波摩那型RZ11株脂多糖主要通过TLR2激活THP-1细胞，释放炎性介质，且致病性钩体脂多糖引起的细胞因子表达水平比非致病性钩体低。作者认为避免TLR4的识别可能是致病性钩体逃避宿主天然免疫的重要因素[10]。Viriyakosol等发现，热灭活钩体主要通过TLR4激活小鼠腹腔巨噬细胞释放炎性介质TNF-α、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)，故小鼠体内TLR4信号途径有利于宿主抵抗致病性钩体的侵入，控制感染[11]。我们应用实时PCR检测致病性钩体赖型毒力株Lai株、赖型减毒株IPAV株和腐生性钩体Patoc型Patoc 1株与THP-1细胞相互作用后对TLR2、TLR4、iNOS表达的影响，发现Patoc 1株可引起TLR2、TLR4和iNOS基因表达升高，而Lai株和IPAV株只引起TLR4和iNOS基因表达升高，且IPAV株引起的TLR4升高水平比Lai株高。未能检测到Lai株激活TLR2，可能与所用菌株血清型不同有关。Goris等也认为，不同血清型的钩体脂多糖结构可能有所不同；同时，他们发现致病性问号钩体巴达维亚型Kariadisatu株可通过TLR2、TLR4和TLR5激活人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)[12]，可见不同血清型以及同一血清型的不同菌株之间，激活巨噬细胞的通路存在差异。致病性钩体进入体内后通过多种受体激活宿主的信号通路，不同信号通路之间相互交叉、相互促进或相互抑制，最终以某种信号通路为主导，激活机体的免疫应答。

革兰阴性菌脂多糖可引起小鼠以大量炎症细胞因子释放为特征的全身性炎症反应。钩体属革兰阴性菌，但钩体脂多糖诱导人PBMC释放炎症因子的能力比大肠埃希菌脂多糖诱导能力低[13]。热灭活钩体可引起人外周抗凝静脉血中辅助性T细胞1型(T helper cell type 1，Th1)中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12p40表达升高[14]。致病性钩体在引起PBMC释放Th1细胞因子的同时，也可引起TCRγδ+T细胞增殖，并在钩体病患者血液中检测到TCRγδ+T细胞水平升高[15]。TCRγδ+T细胞可直接识别抗原，杀灭病原体，不受抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)的限制，并分泌Th1和Th2细胞因子，调节免疫反应。我们应用实时PCR和ELISA分别在mRNA水平和蛋白水平检测钩体与THP-1细胞相互作用后THP-1细胞中TNF-α、IFN-γ、IL-12和MCP-1表达的变化。结果显示，3株钩体都能引起THP-1细胞中TNF-α和MCP-1表达增加，且Patoc 1株和IPAV株引起的TNF-α表达水平比Lai株高。由此推测，Patoc 1株和IPAV株引起细胞因子表达水平比Lai株高，可能有利于激活宿主的免疫反应，清除病原菌，控制感染。Vernel-Pauillac等将致病性钩体感染豚鼠后，未死亡豚鼠外周血中TNF-α、IL-1α、环氧合酶2和IL-10表达水平低于死亡豚鼠[16]。Jongyota等将问号致病性波摩那型钩体和非致病性双曲钩体Patoc 1株与THP-1细胞相互作用，发现致病性钩体诱导THP-1细胞中IL-6表达水平低于非致病性双曲钩体[17]。在研究牛结核分枝杆菌感染中也发现，病理形态改变轻微的动物释放更高水平的IFN-γ、iNOS，从而有利于杀灭细胞内的结核分枝杆菌，控制感染，降低病理损伤[18]。致病性钩体与免疫细胞反应时，释放的细胞因子表达水平低，有利于钩体逃避宿主的免疫反应。本实验中，THP-1细胞与钩体作用后，皆未检测出IFN-γ、IL-12基因表达和蛋白分泌，可能与所选细胞的种类及体内、外实验差异有关。在结核分枝杆菌Beijing株感染早期，巨噬细胞被激活，释放短暂的较高水平TNF-α和iNOS[19]，与体外实验一致。但体外Beijing株与巨噬细胞相互作用同时引起IL-12p40和IP-18表达升高，引起Th1细胞因子表达增高，可见在体内还有其他细胞或菌体成分抑制保护性细胞免疫，且IL-12作用时间比较短暂[20]。Vernel-Pauillac等在钩体病金黄地鼠模型中研究细胞因子表达的改变，IL-12的表达也只是一过性升高[21]。

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