广泛耐药结核分枝杆菌耐药机制及其疾病诊断的研究进展

范晓萍，张文宏

复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040

自20世纪90年代以来，全球结核病疫情回升，其中结核分枝杆菌耐药是一重要原因。尤其是耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的出现给全球结核病的控制带来极大挑战。MDR-TB是指由至少对异烟肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RMP)2种一线抗结核药物耐药的结核分枝杆菌引起的结核病。MDR-TB治疗需要用二线抗结核药物，但2000年全球开始出现对二线抗结核药物耐药的XDR-TB。XDR-TB曾有多种不同定义方式，但因氟喹诺酮类药物和二线抗结核药物药敏试验的可靠性和可重复性高，2006年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将对氟喹诺酮类药物和至少3种二线静脉用抗结核药物﹝卷曲霉素(capreomycin，CM)、卡那霉素(kanamycin，KM)、阿米卡星(amikacin，AM)﹞中1种耐药的耐多药结核分枝杆菌引起的结核病定义为XDR-TB[1]。最近大多数文献报道，2006年全球新增MDR-TB 500 000例，其中7% MDR-TB变异为高致病性XDR-TB。截至2008年底，已在55个国家和地区监测到XDR-TB[2]。XDR-TB诊治困难、费用昂贵、治愈率低、病死率高，是结核病治疗的一大难题。

1 流行病学

WHO和国际防痨和肺病联合会(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD)1994年建立了全球性抗结核药物耐药监测计划。截至2007年，抗结核药物耐药监测项目已完成4轮，覆盖109个国家和地区。2002～2007年第4轮监测结果显示，37个国家和地区报道了XDR-TB， 3 818 例MDR-TB病例中8.0%为XDR-TB(304例)；其中苏联等5个国家分别报道25例及以上XDR-TB，占MDR-TB的6.6%～23.7%[2]。XDR-TB的发病率地区间差异很大，在MDR-TB中所占比例从爱尔兰的0%到塞尔维亚的33.3%不等。据WHO报道，2006年有充分药敏结果的所有MDR-TB中，7%为XDR-TB。尽管现在缺乏全球性关于XDR-TB发病趋势的资料，但MDR-TB的发病数从2000年约27万例增至2006年约49万例，据此推算，XDR-TB的发病例数也在增加[3,4]。截至2010年1月，已有58个国家和地区至少报道了1例XDR-TB病例。我国2007～2008年全国结核病耐药性基线调查发现，每年新发肺结核病约56万例，其中MDR-TB约12万例，XDR-TB约1万例。

2 广泛耐药结核分枝杆菌产生的危险因素及耐药机制

2.1 危险因素

MDR-TB是XDR-TB产生的前提。MDR-TB的出现促使二线抗结核药物的应用，应用过程中又出现了XDR-TB。多篇文献报道，结核病不充分及不合理的治疗与MDR-TB及XDR-TB密切相关。其中Karagoz等报道了土耳其Sureyyapasa胸心血管疾病教研医院结核病患者的耐药情况，新发结核病中MDR-TB发病率为3.2%，而先前接受治疗的患者发病率为13.5%，后者远远高于前者[5]。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)合并感染亦与结核分枝杆菌耐药相关，且HIV合并感染在新发病例中与对利福平单独耐药相关，与其他耐药方式无关[6]。还有多篇文献报道，监狱中犯人MDR-TB的发病率远高于正常人。如Mokaddas等报道，从佐治亚监禁的患肺结核病犯人中分离的结核分枝杆菌对二线抗结核药物高度耐药，从接受过治疗的MDR-TB患者中分离的结核分枝杆菌对2种或2种以上二线抗结核药物耐药的发生率为54%，在新发MDR-TB患者中为17%[7]。Law等对香港地区MDR-TB危险因素进行研究，发现非常住人口、外出频繁及年轻人与复治MDR-TB患者相关，而与初治患者无关[8]。现代交通的发达使耐多药结核分枝杆菌跨区域播散成为可能，传播性耐药值得引起重视[9]。

2.2 耐药机制

XDR-TB的产生主要有以下几种机制：获得性耐药、扩大性耐药和传播性耐药。这3种耐药机制的成因不同。

编码抗结核分枝杆菌药物靶点及相关代谢酶的染色体基因突变是结核分枝杆菌耐单药产生的主要分子机制[10,11]。耐多药是因为多种药物靶基因突变，对结核病患者个体来说耐药性来源于自发性突变[12]，染色体多个相互独立基因自发突变逐步累加是产生XDR-TB的分子基础；多数广泛耐药分离株存在耐单药相关基因改变，推测广泛耐药的产生由相关耐单药基因突变、多代遗传积累所致。尽管就单个患者来说自发突变率很低，但对于载菌量大的患者，针对某种药物的基因突变所致耐药还是可能的。对长期应用一种抗结核药物的患者，该药物的耐药性很快被筛选出来，以耐该药的结核分枝杆菌占主导地位，该耐药形式称为获得性耐药(acquired resistance)[13,14]。

XDR-TB的治疗需要至少4种有效药物或部分有效药物，或5～7种疗效不确切的药物。治疗至痰阴转后18个月，如病变广泛 ，应延长到24个月，治疗时可选择的有效抗结核药物有限。对常见抗结核药物耐药的结核分枝杆菌耐药相关基因见表1。

表1与结核分枝杆菌耐药相关的基因[7]

Tab.1GeneticmutationsrelatedtoresistanceofMycobacteriumtuberculosis

Antituberculosis drugMutated genePercentage of mutationGene productIsoniazidkatG40%-60%Catalase-peroxidase (activates INH)Isoniazid-ethionamideinhA15%-43%Reductase analog (mycolic acid synthesis)IsoniazidahpC10%Hydroperoxidase reductaseIsoniazidkasAUnknownCarrier protein synthaseRifampicinrpoB>96Subunit of RNA polymerasePyrazinamidepncA72%-97%PyrazinamidaseEthambutolembB47%-65%ArabinosyltransferaseStreptomycinrpsL70Ribosomal protein S12Streptomycinrrs7016S rRNAFluoroquinolonesgyrA75%-94%DNA gyrase A subunit

结核病的治疗必须应用2种及以上敏感药物，药物短缺、质量差，治疗不当，患者依从性差，自行停药或终止治疗可导致耐药结核病产生，还可导致抗结核治疗过程中结核分枝杆菌的耐药谱逐步增加，即扩大性耐药(amplified resistance)[13]。

耐药结核分枝杆菌可通过与患者直接接触而传播，该耐药形式称为传播性耐药(transmitted resistance)[13]，也称为原发性耐药(primary resistance)。有数据表明，与MDR-TB患者接触后发展为耐药活动性肺结核的概率较高，故对所有与结核病患者接触的人都应进行密切监测。XDR-TB患者病死率更高，对与其接触者应进行更严密的监测，及早发现，及早治疗，减少传播。

获得性耐药主要是在抗结核药物压力下对天然存在的染色体突变的选择，主要由不恰当化疗造成，反映的是结核病治疗管理的质量。原发性耐药患者所占比例高低主要反映当地耐药结核分枝杆菌传播水平的高低，是评价与制定结核病控制和规划的重要依据。

3 诊断

快速、准确的药敏试验对结核病的预防、控制至关重要，但目前结核病的诊断率低。WHO预计2005年痰菌阳性的新发结核病患者确诊率达70%，但该目标远远没有实现[15]。目前诊断耐药结核病的诊断方法有多种，主要有以下几种。

3.1 传统培养方法

目前的“金标准”是琼脂比例法(agar proportion method)[16,17]，可准确计算对某种药物耐药的结核分枝杆菌比例。有实验比较改良罗氏培养基直接比例法与广泛应用的改良罗氏培养基间接比例法，前者在MDR-TB发病率为2%、5%、20%和50%的人群中效价比最高。然而液体培养法(liquid culture method)对于一线抗结核药物更可靠[16,17]。氟喹诺酮类药物和静脉用二线抗结核药物的药敏试验相对其他二线药物更准确、可靠。然而传统培养方法需8～12周，有一定的滞后性，在治疗过程中可能会有新的耐药结核分枝杆菌出现，不能及时反映目前耐药情况。

3.2 液体培养基法

自动化液体培养系统有更高的敏感度，但需2～4周出结果，且费用昂贵。BACTEC-460 辐射测量系统可连续检测接种标本的培养管荧光强度变化，判断是否有结核分枝杆菌生长，目前该系统已被结核杆菌生长指示管(Mycobacteriagrowth indicator tube)960系统取代。后者可快速检测结核分枝杆菌对一线、二线抗结核药物的耐药情况，仅需数天即可出结果，但费用较昂贵。2007年WHO公布了在资源贫乏地区液体培养法、药敏试验及快速菌种鉴定的指导政策。

3.3 快速表型检测法

快速表型检测法包括镜下药敏检测法(microscopic observation drug-susceptibility assay，MODS)、TK medium、FASTPlaque-Response等。以传统方法作标准，MODS对利福平药敏一致率为100%，对异烟肼药敏一致率为97%，对利福平合并异烟肼药敏一致率为99%，对乙胺丁醇和链霉素的药敏一致率略低，分别为95%和92%。MODS的最大缺点是需要倒置显微镜观察结核分枝杆菌的生长情况[18]。TK培养基是一种比色法，可在菌落长出前通过观察培养基的颜色改变来检测细菌的生长活性，并可鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，也可进行药敏试验，但目前尚缺乏该方面的文献资料。FASTPlaque-Response是一种噬菌体扩增法，可直接应用于痰标本，并可对含有药物的标本进行药敏检测。该方法敏感度高，但特异度较差，目前缺乏直接应用于痰标本的足够证据。

3.4 免疫学方法

近年来发展了新的细胞免疫检测方法——γ干扰素释放试验(interferon γ release assay，IGRA)，即用结核分枝杆菌抗原与可疑感染者的全血或单个核细胞体外37 ℃孵育过夜，用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或酶联免疫斑点(enzyme-linked immunosorbent spot，ELISPOT)法测定致敏T细胞受抗原刺激后IFN-γ释放水平，从而判定是否有结核分枝杆菌感染[19]。但该法受患者自身免疫条件影响，敏感度、特异度不够，且不能鉴别潜伏期结核和活动性结核。

3.5 分子生物学新技术

分子生物学技术可在数小时至数天内检测出对某种抗结核药物耐药的结核分枝杆菌特定基因突变，不需要结核分枝杆菌培养及药敏试验，且敏感度较传统方法大大提高。如表1所示，对利福平耐药患者中，结核分枝杆菌95%有rpoB基因突变[17]。因利福平单耐药率低，所以可将利福平耐药检测作为MDR-TB统计的替代指标。GenoTypeMTBDR线性探针技术对利福平耐药检测的敏感度、特异度高，可直接用于抗酸染色阳性的呼吸道分泌物标本及培养株检测[16]。GenoTypeMTBDRplus可用于对异烟肼耐药的inhA基因启动子区域及对利福平耐药的rpoB基因的热点突变区域进行检测。该方法对异烟肼耐药检测的敏感度为84%(70%～90%)，特异度为99%[16]。目前已开发出针对二线药物检测的GenoTypeMTBDRsl技术。DNA直接测序是检测耐药基因突变的另一方法，准确率高，但费用昂贵，需要特定的实验室设备。分子生物学技术可以迅速、准确检测出针对某种抗结核药物耐药的结核分枝杆菌突变基因，但并不是针对所有的耐药药物都能检测到相应的基因突变，到目前为止还有许多抗结核药物耐药相应突变基因未能发现。此外，不同药物的基因突变有不同的地理分布特点，目前还缺乏统一的分子生物学方法作为检测未知耐药基因的标准，需进一步对不同地区耐药基因特点进行研究，以建立统一的诊断标准。

4 结语

XDR-TB治疗指南推荐对每个患者必须采用从标准化、经验化到个体化的治疗方案，根据患者用药情况、药敏结果制订合理的治疗方案，采取DOTS-Plus方法，指导并监测患者用药。目前XDR-TB治疗效果缺乏大样本、多中心的文献资料。MDR-TB治疗时间长，至少18～24个月，需应用昂贵、毒性大、疗效差的二线药物。描述性研究发现，其治疗成功率远低于敏感结核病，仅为75%[20]。XDR-TB治疗效果比MDR-TB更差，病死率和治疗失败率更高[21,22]，尤其是在合并HIV感染的患者。

总之，XDR-TB治疗时间长，病死率高，治疗效果差，目前可用药物种类有限、费用昂贵、不良反应多。目前尚缺乏快速、准确的诊断方法，药敏试验诊断技术的滞后是耐药结核分枝杆菌传播及耐药产生的重要原因之一，亟需开发快速、准确的新型诊断方法。加强对耐药结核病患者的管理，规范耐药结核病患者的治疗，同时应对与XDR-TB患者接触的人群及潜伏期XDR-TB患者进行有效治疗,减少耐药结核分枝杆菌的传播。对XDR-TB的治疗是一项任重而道远的任务，需要医务工作者、研究人员、政府等多方的共同努力。

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