浅析钩端螺旋体菌种的长期保存

徐颖华,叶 强,徐 苗

钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的一种急性人兽共患传染病[1]。随着全球气候愈发变暖以及日益城市化引起了钩体的动物宿主环境改变,即便是在一些经济发达的欧美国家,报道的钩体病例数也呈现增多的趋势[1-2],因此钩体病预防和控制已引起各级公共卫生管理部门重视。

钩体病原体的种群丰富、多样性,至今,已在世界不同国家和地区共报道了近30种血清群300多种不同血清型钩体,且仍不断有新的血清型钩体被报道[3]。为了更好监测钩体血清群(型)的流行趋势变化,研究人员根据世界上不同国家和区域主要流行菌群选择了24群代表株用于钩体血清群的分类检测。而中国为钩体菌种资源最丰富的国家,从不同时期数千株流行血清群中选择出15群代表株,并以此筛选出76个血清型代表株,其中大部分菌株也是我国钩体灭活疫苗的生产用菌株或检定用菌种,这些代表性菌种是钩体流行病监测和疫苗生产最重要的物质基础之一[4]。由于钩体的培养和生长特性,目前仍没有成功解决钩体冻干保存方法,如何长期、有效保存钩体一直困扰着从业人员。为更好了解钩体的长期保存钩体方法,本文将就钩体在不同环境的存活能力、各种不同保存钩体方法的优缺点以及面临的问题与挑战进行综述。

1 钩端螺旋体在不同环境的存活能力

钩体属按照致病性可分为问号钩体和腐生性钩体,前者分离自病人和动物,具有寄生性;而后者通常对人或动物不致病,常见于环境土壤和水中[5]。尽管问号和腐生性钩体在人工制备培养基上需要相类似的营养和温度等条件才能生存,但研究发现腐生性钩体在适宜的水环境中可以长期存活,而致病性钩体在不同自然环境中存活能力也不尽相同,例如发现澳洲群钩体可在30 ℃的稻田水存活7～14 d,但在42 ℃环境中仅能存活3 h[6],表明不同的致病特性决定了钩体属内不同种在不同自然环境的存活能力,而环境因素也将影响钩体的存活。事实上,大量研究发现了致病性钩体主要与环境的温湿度、pH 值以及生长所必需营养密切相关。例如钩体在非常清洁的水中(例如泉水),或污染严重的水中,存活的时间都比较短。而在稻田水和荒弃池塘水的存活时间长[6-7]。此外,研究人员还发现钩体可与其他微生物形成生物膜,被认为与钩体在自然环境中持久存在密切相关[8]。

2 室温定期传代保存

在日常教学和科研实验活动中,通常将钩体菌种保存在含兔血清的EMJH、磷酸盐或其他适宜培养基中,放置室温在18 ℃～20 ℃的干燥、通风性好的暗橱中,并定期(每隔1～3个月)传代1次。当前我们实验室仍然采用这种方式长期保存菌种[4]。多年经验发现这种方式可以长期保存钩体菌种,且菌种仍具有良好的抗原反应性。但也存在以下缺点:1)经反复传代,菌株毒力和致病力大大降低;2)长期传代,菌种的基因组发生一定遗传变异;3)多次传代增加了杂菌污染的风险。4)需专人负责菌种、费时费力、成本较高。

为了克服上述需要定期传代的问题,Wuthiekanun等[9]开发了一种简单实用的保存钩体方法,将100μL的浓度约为107CFU/mL 钩体接种至含有5 mL 已高压灭菌的Leptospira Vanaporn Wuthiekanun琼脂培养基的小管中,拧紧后放置在25 ℃～30 ℃保存。100株致病性钩体采用这种方法保存12个月后,发现所有菌株复苏均可存活。这种培养基中主要含有3种核心成分,包括EMJH 培养基、琼脂和兔血清。无需频繁的传代,减少了污染的风险,且凭肉眼观察便可判断钩体的生长能力。但由于保存12个月后观察到琼脂干燥,提示可能不适合长期保存菌种,也需要定期转种。

3 低温冻存

低温冷冻是保存原核微生物最简单有效方法之一,在低温状态下,微生物内所有细胞和代谢活动停止,几乎不影响微生物的生理和遗传特性[10-12]。早在70年前,研究人员发现将钩体放置－80 ℃冰箱中,大部分钩体均可复苏存活。然而应用低温冷冻原核微生物,在微生物体内不可避免地发生结冰,引起其脱水和变性,影响微生物复苏存活[12]。为了提高钩体的低温冰冻保存的存活率,研究人员探索添加不同保护剂和培养基,例如甘油、羊血和EMJH液体培养基,发现常用的细菌冻存保护剂对于保存钩体效果不明显,而单独用EMJH 液体培养基用于保存6种不同血清型钩体,放置的－70 ℃冰冻后6、12和20个月后,复苏均能成功存活[10]。

此外,研究证实低温冻存时钩体浓度可影响后续复苏存活率。将浓度为(107～109)CFU/mL 钩体感染的仓鼠肾脏冰冻后能成功复苏钩体,而钩体浓度为103～104CFU/mL 感染的仓鼠肾脏则不能[11]。此外,Samir等发现将6种钩体血清型浓度为3×108CFU/mL 的EMJH 液体培养基－70 ℃冰冻后20个月后,均100%复苏存活[10]。这些研究结果提示合适培养基和冻存时钩体浓度与低温长期保存相关[12]。

4 液氮保存

研究人员应用液氮保存钩体菌种的探索性实验研究,将用钩体菌感染豚鼠后,抽取血液按1%量接种于含10%兔血清的Stuart培养基中,再加入10%无菌甘油保存于—168 ℃的液氮中,5 年后观察中大部分菌株的运动性和毒力未见明显变化,但也发现液氮保存的103株中有9株未能获得复苏,建议可能由于微生物污染或冻存的菌种浓度偏低造成[13]。我们实验室也曾将致病性和非致病性钩体菌种进行液氮深冻钩体菌种的存活率和复苏率进行了观察,366株菌种在深冻保存24个月后,存活复苏率高达99%,表明含有10%兔血清的钩体培养物可直接用于液氮保存[14]。

尽管很多钩体实验室建议使用液氮冷冻来长期保存钩体菌株,但使用的培养基、保护剂以及具体冷冻步骤也不尽相同[13]。为推动液氮保存钩体菌种的标准化工作,2008年研究人员发表了详细的液氮冷冻来长期保存钩体菌株的操作规程,用10%甘油作为冷冻保护,在干冰中快速冷冻,然后立即浸入液氮中。43株钩体菌株,分别在液氮中储存6、18和54个月后,菌种复苏成功率为100%、93%和83%[15]。

5 面临的挑战

为了更好预防和控制钩体感染,监测钩体病的主要流行菌群、早期诊断和治疗钩体病,如何长期、有效保存不同血清群钩体代表株显着尤为重要。正如前面所述不同的保存方法各有优缺点,为了确保长期获得高质量的可用的钩体菌种,应进一步优化钩体菌种长期保存方法和策略,解决目前面临的一些问题。

5.1 保存方法的标准化 尽管有多种不同方法推荐用于钩体菌株的长期保存,包括长期保存在18℃～20 ℃定期传代、低温冰冻和液氮保存等。但不同实验室所用的培养基、保护剂及其浓度和钩体冻存浓度也不尽相同,这些因素势必对保存的钩体存活率产生一定的影响。为了提高长期保存钩体的质量和存活率,建议由钩体专业实验室牵头和组织不同钩体保存方法标准化研究工作,并起草每种保存方法详细的操作规程,以供不同实验室使用。

此外,为了保持钩体人用疫苗菌种的毒力与纯度,在2020版中国药典中建议,每种疫苗菌种每传3～6代后,选用120～220 g豚鼠进行定期传代,取感染豚鼠少量心血接种于液体培养基中以分离钩体菌种,并对分离的钩体物进行血清学特性、管家基因检查和毒力测定[16]。而国外研究机构更倾向于用金黄色地鼠作为钩体增毒动物模型[5-6],但所有动物体重、钩体浓度以及后续如何从动物体内分离和获取钩体基本都没有详细介绍。因此,为了保证保存钩体的质量,建议推荐开展钩体增毒动物模型的标准化研究,形成统一的操作规程。

5.2 深入研究钩体的毒力变化特性 大量研究证实钩体多次传代后,菌株的毒力将明细降低,甚至消失[5-6,8]。研究人员结合应用多种组学技术证实了强毒力的黄疸出血群钩体赖株基因组中较其无毒株仅存在88个插入或缺失和301个单核苷酸突变位点,但蛋白质组学分析结果发现强毒株有228个蛋白翻译、DNA 修复相关基因表达上调,表明关键基因的突变影响蛋白表达,从而改变菌株的毒力[17]。我们实验室对4对有毒力菌株包括黄疸出血群赖株、秋季群临4株、流感伤寒群临6株及波摩那群罗株及其对应的无毒株进行比较基因组学分析也发现钩体菌株通过动物宿主体内传代保持毒力时,共有161个基因受到正选择影响发生突变,其中47个为细菌毒力相关基因[18]。这些研究结果提示致病性钩体中一些基因和蛋白表达的改变可直接影响细菌的毒力。

因此,解析其分子和毒力变化内在机制,必将助力长期保存方法优化和开发。

5.3 开展全国范围内钩体血清和分子流行病调查 尽管在我们一些传统钩体疫区省份都会进行钩体动物宿主监控,但由于各省市实验室检测水平参差不齐,且样本易受采集、分离和检测手段等因素的影响,可能导致钩体检出和报告率偏低[19-20]。事实上,当前我国所用的钩体疫苗株和不同血清群的代表株分离时间均超过30年,现阶段是否具有代表性? 至今,基于部分省市分离菌株研究结果发现,中国钩体流行菌株群体独特、菌型复杂,其分子流行趋势和进化历程可能与其他国家不同[20-21],因此建议系统评价我国钩体病的疾病负担,开展全国范围内钩体血清和分子流行病调查,不仅可为完善我国防控钩体感染提供科学指导,同时也将通过分离培养获得大量的流行菌株,为后续钩体疫苗株和代表株的筛选奠定厚实的菌株资源库基础。

5.4 加大钩体菌种长期保藏的投入 随着报道钩体病例数的降低,各级公共卫生防疫部门不可避免将减少该传染病的关注。同时,在为数不多的钩体专业实验室,为了长期保存钩体菌种,需要定期液体培养基传代,工作量大,且菌种存在变异、污染和丢失的可能。尤其是生产人用的钩体疫苗厂家,需要定期进行动物体内传代,工艺十分繁琐,对操作技能要求较高,且由于疫苗市场需求不足,生产的大部分钩体疫苗成品中报废又占有相当数量,企业经营的成本压力偏大,建议应由国家层面加大专项经费投入,不仅有利于钩体病的防控,也将保障中国钩体菌种微生物资源长期保藏。

6 结语

回顾过去几十年,但随着生物医药产业和技术的发展,抗生素不断更新换代以及经济卫生条件的改善,全球在预防和控制钩体感染取得了巨大成就,但在一些国家和地区仍不断有散发钩体感染病例,甚至小规模钩体疫情暴发[22]。因此,长期保藏用于钩体血清群(型)检测用的代表性菌株以及用于制备疫苗用的生产菌株仍然重要。为了避免重要钩体菌种的丢失,推荐现有的钩体专业实验室和疫苗生产厂家至少用2种保存方法对现有代表性菌种和疫苗株进行长期保藏。同时,国家应该加大对中国微生物资源保藏和整理的经费投入,开展钩体菌株长期保存方法及相关毒力特性研究,开发完善出简单、方便且能保留钩体生存能力以及在长期保藏后遗传和毒力稳定的方法,并以此推动钩体保存方法标准化。

(感谢武汉生物制品研究所有限责任公司孙晓艳给予的帮助。)

利益冲突:无

引用本文格式:徐颖华,叶强,徐苗.浅析钩端螺旋体菌种的长期保存[J].中国人兽共患病学报,2022,38(6):469-472.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.090