细菌的群体性行为与耐药

王辉，杨崇广，牛辰

复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

细菌耐药(drug resistance)是一个复杂的现象，涉及细菌本身、环境与宿主这几个既相互独立又相互作用的因素[1]。目前广泛认同的细菌耐药机制主要有以下几种：阻止药物进入微生物机体[2,3]；阻止药物与其靶点结合[4,5]；微生物机体产生钝化酶，使药物失活或修饰改变[4,5]；改变药物作用的靶点[4,5]。

在微生物研究领域中，通常以游离状态下的单个细菌为对象，研究各种生理现象及机制，包括细菌耐药性及其机制。近年来，微生物学家越来越关注细菌作为一个群体所表现出来的有别于其游离状态的行为[6]。其中，细菌的群体性行为与耐药性的关系是近年来的研究热点。一般认为，生物膜(biofilm)、群体感应(quorum sensing)和程序性死亡(programmed cell death，PCD)是细菌群体性行为中的3个重要内容。但是，群体感应往往是细菌通过调控一些耐药相关基因的表达或其他影响细菌耐药的机制与耐药性相关[7]，并非是细菌自身的直接作用。因此，本文就细菌生物膜和程序性死亡与耐药性的相关研究进展进行综述。

1 细菌的生物膜与耐药

生物膜是指细菌不可逆地黏附于物体表面及细菌间相互黏附，并被其自身分泌的细胞外基质所包裹形成的结构[8]。生物膜是细菌在自然界存在的一种普遍状态。在感染过程中，与游离态细菌相比，形成生物膜的细菌生长较缓慢且基因表达发生改变。生物膜的形成提高了细菌抵抗宿主机体免疫系统和抗生素的能力，成为不断产生游离细菌的储藏所[9,10]。生物膜与多种细菌的毒力相关且参与致病过程，在耐药性的发生、细菌的压力应答、规避宿主的防御机制和持续性感染中具有重要作用，因此生物膜的形成与细菌的耐药性密不可分[9,11,12]。美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)报道指出：“超过80%的细菌感染与生物膜相关”，而且细菌在生物膜状态下对药物的抵抗能力是其游离状态的10～1 000倍[13]。

关于这种天然耐药性的分子机制，以往的研究提出以下几种可能的解释：生物膜的存在限制抗生素的渗透[14]；营养限制导致细菌生长代谢缓慢[15,16]；压力耐受基因的激活表达[17]；群体效应形成的特异表型[18,19]；外排泵(efflux pump)的表达增强[20]。大多数观点认为，生物膜的耐药性本质是由于黏膜深处的细菌很少接触抗菌药物，然而这个理由并不充分。最近的研究揭示了生物膜耐药的其他原因，如生物膜中顽固耐药菌(persister cell)的存在[21]。

1.1 渗透限制

一直以来，抗生素不能有效穿透所有生物膜被认为是细菌耐药的普遍原因。细菌在生物膜状态下的特征是密度大，有以多种不溶于水的胞外多糖为主要成分的胞外基质，由此组成的网络状支持结构形成阻碍抗生素穿透的屏障[19]。因此，抗生素只能杀灭表层细菌，无法以有效浓度渗透至生物膜内部。Larsen等研究发现，当浮游状态的牙龈卟啉菌(Porphyromonasgingivalis)的密度与生物膜状态相当时，尽管细菌在生物膜状态下对多西环素(强力霉素)和甲硝唑的耐药性是浮游状态的2～8倍，但羟氨苄青霉素、多西环素和甲硝唑的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)显著增加[22]。Roque等报道将金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的胞外基质洗去后，细菌对药物的敏感度上升到浮游状态时的90%以上[23]。也有些研究提出其他观点，如Stewart等发现达托霉素可以在数分钟内渗透到一株流行的金黄色葡萄球菌形成的生物膜中[24]。另外，一些学者研究获得的结果相反，即尽管抗生素渗透整个生物膜，但细菌依然不敏感。由此可见，渗透限制并不能完全解释生物膜的耐药机制。

1.2 生长限制

许多研究者认为，细菌在生物膜状态下生长速率下降是细菌耐药的重要原因之一[15,16]。生物膜造成营养物质从外到内呈现梯度下降，导致不同营养状态下细菌的代谢速率不同，最底层的细菌往往处于持续性潜伏的静止状态[25]。以往的研究表明，处于静止状态不分裂的细菌会逃避大多数针对杀灭活跃状态细菌的抗生素，因此一些研究者认为这样的生长缓慢状态将降低细菌对大多数抗生素的敏感度。

1.3 顽固耐药菌

顽固耐药菌是指那些始终对抗生素具有抗性的细菌。早在60多年前，就发现在抗生素敏感细菌中存在极少的一部分耐受细菌，顽固耐药菌与耐药突变细菌不同，具有可逆性和非遗传性[26]。然而，由于极难分离出足够数量顽固耐药菌用于实验，该相关领域的研究沉寂了40多年。最近在生物膜中发现了顽固耐药菌，重燃起研究者的兴趣。在细菌中某些调控程序性细胞死亡的基因发生突变可以增加顽固耐药菌的耐药性，表明细菌在生物膜状态下发生的程序性细胞死亡与其耐药有关。

2 细菌的程序性死亡

程序性细胞死亡最早由Lockshin 和Williams于1964年提出，也称细胞凋亡(apoptosis)，是由细胞本身程序性自杀机制介导的细胞死亡现象[27]。该现象在真核多细胞生物中广泛存在，是维系个体稳定、功能平衡和正常发育所必需的。随着微生物学研究的不断深入，人们发现细菌等原核生物在应对环境压力带来的生存危机时，会产生与真核生物细胞凋亡相似的自杀现象，称为细菌的程序性死亡[28,29]。

目前研究较多的介导程序性死亡的机制有2类：一类是在压力应激下由毒素抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系统介导的，具代表性的是大肠埃希菌(Escherichiacoli)的mazEF操纵子；另一类是枯草芽胞杆菌(Bacilliussubtilis)在细胞功能分化过程中介导的程序性死亡[30,31]。

2.1 大肠埃希菌的TA系统

TA系统包括1对基本的组分，即一个相对稳定的毒素基因与一个可干扰毒素反应的不稳定的抗毒素基因[31]。在大肠埃希菌中，被研究最清楚的是mazEF系统，它由2个定位于relA基因下游的邻近基因mazE和mazF组成[32]。mazE编码抗毒素蛋白MazE，mazF编码毒素蛋白MazF[33]。一般情况下，MazE与MazF在细菌内相互拮抗，不会对细菌的生长产生影响。一旦有某种外界因素打破这种相对平衡的体系，由于MazE不稳定容易被降解，MazF不断积累，最终导致细菌的程序性死亡。这些因素包括氨基酸的过度缺乏[33,34]、抗生素(如奇霉素、利福平)的应用[35]、Doc蛋白(一种广谱翻译抑制剂)的存在[36]、过氧化物(如H2O2)的应用[37]、胸腺嘧啶缺乏、丝裂霉素的应用、萘啶酸的存在和紫外照射等[37,38]。

也有学者认为，TA系统导致细胞死亡仅仅是通过抑制大分子的表达而可逆地抑制细菌生长[39,40]，而毒素的存在使处于静止状态的细菌在其相应抗毒素基因表达时重新被激活的结果支持了上述观点。

2.2 枯草芽胞杆菌的程序性死亡

一般情况下，在营养缺陷时，枯草芽胞杆菌容易形成芽胞，这一过程由调节蛋白Spo0A介导[41]。Losick等提出，程序性死亡过程延迟了枯草芽胞杆菌形成芽胞的时间[42,43]。当营养缺陷时，群体中一部分细菌的Spo0A被激活，称为“Spo0A-ON”细菌；剩下的细菌没有被激活，称为“Spo0A-OFF”细菌。“Spo0A-ON”细菌在芽胞形成早期，调节蛋白Spo0A上调表达skfA～H和sdpABC。skf操纵子在形成芽胞的过程中产生胞外杀伤因子，而skfE与skfF分别募集ATP结合蛋白与转运复合体，从而将体内的杀伤因子泵出。同时，sdpABC也被诱导表达。SdpC是一个具有毒性的信号蛋白，细胞自身由于具有sdpRI操纵子而对其产生抗性。一般情况下，sdpRI操纵子受AbrB的抑制，而Spo0A蛋白可抑制AbrB的表达，使细菌免受SdpC的伤害。“Spo0A-OFF”细菌由于不能表达Spo0A蛋白，不能对抗毒素及SdpC，故出现程序性死亡[31]。

2.3 细菌程序性死亡与耐药

令人惊讶的是，其他细菌体内也广泛存在类似大肠埃希菌的TA系统，说明其在细菌生存过程中发挥一定作用。近期研究发现，这种与生俱来的自杀现象与细菌生理学、细菌耐药性和生物膜形成等有密切关系[26,44,45]。程序性死亡尽管在单个细菌中往往是一种消极反应，却有利于群体的生长。已知细菌程序性死亡的作用主要有如下几方面。①抵抗噬菌体感染蔓延[46]。Hazan等的实验表明，溶源性噬菌体的感染对于缺失mazEF的大肠埃希菌是致死的，而同样条件下野生细菌中检测不到噬菌体，因为它们可通过MazEF的致死作用将那些已经感染的细菌杀死，避免噬菌体感染的蔓延。②保持细菌群体基因的稳定[47]。由于细菌的繁殖迅速，每次分裂染色体都会发生不同程度损伤，通常这种损伤可由细菌拥有的修复机制予以修复。在修复系统无法修复的情况下，由MazEF介导的程序性死亡被激活，清除那些基因损伤的细菌，从而保持群体的基因稳定。③对营养极度缺乏的反馈。在营养物质极度匮乏的环境中，细菌群体会通过使一部分细菌程序性死亡而获得生存所需的营养，其代表是枯草芽胞杆菌的程序性死亡[33]。④与细菌耐药相关。抗生素并不直接杀死细菌，而是通过造成细菌损伤使其自杀。在抗生素存在时，那些像多细胞生物一样可以从缺陷细胞的程序性死亡中获取更多生存机会的细菌更易产生耐药性，否则会导致群体死亡。限制那些经过修复仍然有缺陷的细菌利用有限资源的能力对于细菌群体适应环境是十分重要的。如顽固耐药菌内的程序性死亡过程是受抑制的，当细菌群体受到抗生素威胁时，顽固耐药菌比其他细菌更易产生耐药性[26]。

3 结语

细菌耐药是一个复杂的过程，与细菌本身、宿主和环境这几个因素密不可分。其中，对细菌自身的研究格外重要。生物膜和细胞程序性死亡是细菌群体性行为的两个典型方面，研究它们的机制必将成为认识和对抗细菌耐药的关键。

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