霍乱弧菌检测方法的研究进展

沈小婷，赵雪涛

上海市徐汇区疾病预防控制中心，上海 200237

霍乱弧菌(Vibriocholerae)是烈性肠道传染病霍乱的病原体，可导致感染者剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡。霍乱是一种流行广泛的烈性传染病，在世界范围出现多次大流行，病死率甚高。霍乱弧菌的快速、准确检测是制定霍乱预防、控制政策的重要依据。国内、外对霍乱弧菌进行了大量研究，建立了许多有效的检测方法，其中传统细菌培养、生化检测、血清学分型及噬菌体分型已广泛应用，并作为常规检测手段。近年来，分子生物学技术以其高敏感度、高特异度，操作简便、迅速等优点越来越多应用于霍乱弧菌的检测及分型研究。本文就近年来国内、外对霍乱弧菌检测方法的研究进展进行综述。

1 传统检测方法

霍乱弧菌为需氧或兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，常以碱性蛋白胨水作为其选择性增菌培养基。霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中生长迅速，可将标本在37 ℃培养6～8 h后取上层培养物做弧菌分离。霍乱弧菌在营养琼脂和碱性琼脂上呈无色、圆形、透明、光滑、湿润、扁平或稍凸起、边缘整齐的菌落。为便于检出，根据其生长特性、对某些抗生素的敏感性及与其他常见肠道菌的差别，国内已研制出庆大霉素琼脂、四号琼脂，国外有TCBS等选择性培养基。这些培养基一般都含有胆盐、亚碲酸钾、十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、庆大霉素、多黏菌素等抑菌剂。在不同的选择性培养基上，霍乱弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需进行一系列生化反应、血清凝集等试验，对结果进行综合判定，从而确定为霍乱弧菌[1,2]。目前，细菌培养、生化和血清学鉴定仍是霍乱弧菌实验室诊断的“金标准”，具有较好的敏感度和特异度。但不可否认，传统方法检测周期长、工作量大，且易受环境、培养条件及主观因素影响，不能满足疾病预防和控制快速反应体系的需求，不利于实验室的快速诊断。

2 分子生物学方法

2.1 聚合酶链反应

2.1.1普通聚合酶链反应运用常规聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测霍乱弧菌，一般选择霍乱肠毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作为靶基因[3,4]。一些非产毒株(如环境来源的菌株)有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株，若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此，霍乱弧菌的其他重要基因，如毒力协同调节菌毛A基因 (tcpA)、O抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表达调控基因(toxR)等也被选用为PCR的靶基因[5,6]，这大大提高了检测的特异度。PCR方法检测霍乱弧菌的特异度和敏感度都很高，但其本身也有缺点：一是因样本DNA交叉污染而出现假阳性；二是由于待测样本中的某些杂质蛋白及核酸提取过程中用到乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、SDS等，如未去除干净就会成为TaqDNA聚合酶的抑制剂，造成扩增失败。此外，标本中也可能含有会降解靶核酸的核酸酶，导致假阴性结果。因此，在运用PCR检测霍乱弧菌时，要注意避免DNA污染以及其他杂质的干扰。

2.1.2多重PCR与常规PCR相比，多重PCR一次反应可检测多个基因，节省了时间和成本。国内、外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、tcp与其他基因如ompW、rfb、hly进行组合[7]，作为共同的靶基因，克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重PCR同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株，可谓一举多得，大大提高了检测效率。

Tarr等[8]运用多重PCR技术同时检测霍乱弧菌和拟态弧菌的sodB、副溶血弧菌的flaE、创伤弧菌的hsp等基因，Gómez-Duarte等[9]运用多重PCR从腹泻患者的临床标本中同时检测到包括霍乱弧菌在内的7种肠道致病菌。这些都大大提高了感染性腹泻病原学诊断的效率和水平，为多种致病菌的快速诊断提供了很好的思路和方法。多重PCR的引物设计要注意避免各对引物之间的相互干扰和各目的片段之间的非特异性扩增。

2.1.3荧光定量PCR荧光定量PCR自动化程度高、特异性强、无交叉污染，在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来，随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光PCR仪的开发与广泛使用，多重荧光定量PCR技术日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测，成为应用的热点。Huang等[10]选取O1和O139群特异的rbf基因以及ctxA、hylA等作为靶点，建立了四重荧光定量PCR体系，不仅克服了单重荧光定量PCR仅检测毒力基因特异度不高而造成假阳性的缺点，而且能很好检测并区分O1群和O139群霍乱弧菌及其毒力株，最低检出限达每个反应2个菌落形成单位(colony forming unit，CFU)。这与单重荧光定量PCR的最低检出限相当，降低了检测成本，提高了检测效率。Fykse等[11]运用基于分子信号标记的多重荧光定量PCR体系检测环境标本中霍乱弧菌的ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多个基因的不同组合，在一定程度上削弱了标本中杂质的干扰，提高了PCR技术对环境标本检测的特异度，敏感度也较TaqMan探针和SYBR Green I方法提高了100倍。可见，多重荧光定量PCR技术已成为未来检测技术发展的趋势，但必须保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，且各目的片段有相近的扩增效率。

2.2 基因芯片

与PCR方法相比，基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息，从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析，对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。但基因芯片成本较高，距离推广应用尚需时间等待。

2.3 环介导恒温扩增技术

环介导恒温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是2000年Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。此方法针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(60～65 ℃)孵育40～60 min，引发自动链循环取代反应，完成对靶基因的扩增。扩增产物可通过电泳或直接通过副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行检测。Yamazaki等[13]采用LAMP检测霍乱弧菌的ctxA基因，最低检测限达每个反应1.4 CFU，比普通PCR高近10倍，说明该方法具有很高的灵敏度。

3 免疫学方法

3.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)一般不需要分离即可直接对样品进行检测，操作简便。国内、外已有许多学者制备了针对O1群、O139群霍乱弧菌的单克隆抗体，特异性检测这2种细菌。Tuteja等[14]用含有ctxB和ompW片段的重组蛋白免疫小鼠，制备了分别针对这2种抗原的单克隆抗体；同时检测并区分了临床及环境标本中霍乱弧菌的产毒株和非产毒株，其检出限达102CFU/ml，大大提高了此类方法的特异度和敏感度。

3.2 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术具有简单、快捷、易于判读结果的优点，已有多种商品化的O1群、O139群霍乱弧菌快速检测试纸条，广泛应用于该菌的临床检测。但其检测灵敏度和特异度较差。Mukherjee等[15]应用Dipstick Kit检测O1群、O139群霍乱弧菌，与传统的培养鉴定方法比较，具有更高的灵敏度和特异度。

4 结语

采用分子生物学技术研究霍乱及其流行病学特征，可从分子水平阐明霍乱发生、发展、分布等规律，为霍乱弧菌的检测和研究提供更多的思路和方法，逐渐成为未来检测技术的发展趋势。但有些新技术的应用至今仍然存在一定障碍，如PCR技术本身的缺陷造成假阳性或假阴性结果，引物设计、操作技巧等也造成其应用上的缺陷；再如基因芯片从研究走向临床，关键的技术问题(简化样品制备和标记技术、增强检测信号灵敏度、提高芯片检测特异度、芯片检测全过程自动化及降低检测成本等)不可回避。应将传统的微生物检测技术与分子生物学技术联合应用于病原微生物的检测和研究，尤其是当发现未知病原体时，需借助微生物学、免疫学和分子生物学等方法确定病原体，只有这样才能真正提高病原微生物的检测和研究能力。

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