葛根素对噪声性聋的防治作用

陈鑫 邱建华

噪声对听力的影响历来受到关注，但目前尚无有效的治疗手段。葛根是一种常见的中草药，其主要活性成分葛根素为异黄酮物质，因具有改善微循环、清除自由基等作用已广泛应用于临床，包括心脑血管疾病以及突发性聋的治疗。本实验旨在探讨葛根素对噪声性聋的防治作用。

1 材料与方法

1.1材料 健康(耳廓反射正常)雄性白化豚鼠18只，体重300～350 g，由第四军医大学动物实验中心提供。主要试剂：葛根素注射液(陕西安康正大制药有限公司，2 ml:0.1克/支)，抗硝基酪氨酸兔多克隆抗体(CHEMICON公司)，即用型SABC试剂盒(武汉博士德公司)，DAB显色试剂盒(中杉金桥公司),鬼笔环肽(Sigma公司)。主要仪器：SS-1型声刺激器，2×50 W功率放大器，AZ8928型噪声分析仪，ABR检测仪(美国Bio-logic SYSTEMS CORP)，正置荧光显微镜(OLYMPUS BX51)，冰冻切片机(LEICA CM1850)。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 18只雄性豚鼠随机分为空白对照组、单纯噪声组、噪声+葛根素组，每组6只。造模期间每只动物都安置在特别定制的小隔中，各处噪声强度差别不大于3 dB。在实验期间动物可以自由摄取食物与水，环境噪声40±5 dB(A)。正常对照组不予噪声处理，并于每日上午8～10点腹腔注射生理盐水2 ml，持续10日。单纯噪声暴露组每日上午8～10点腹腔注射生理盐水2 ml，持续10日，并于实验第3天中午12点开始给予噪声暴露。噪声加葛根素组每日上午8～10点腹腔注射葛根素注射液(150 mg/kg)，持续10日，同样于实验第3天中午12点给予噪声暴露。噪声发生系统由SS-1型声刺激器和2×50 W功率放大器两部分组成。试验动物置于噪声接收笼内，扬声器位于噪声接收笼顶部，用AZ8928型噪声分析仪监测笼内声强级。每只动物给一次噪声刺激，噪声为4 kHz纯音，强度128 dB SPL，时间为6小时，分别于实验第1、4、7、10天对各组豚鼠进行ABR检测。在第10天给药结束后，每组中分别随机抽取2只进行基底膜铺片染色、2只进行冰冻切片的制备及免疫组化染色。剩余动物正常饲养，不予其它处理，以备补充实验。

1.2.2ABR测试 ABR检测仪器为Bio-logic SYSTEMS CORP(美国)。动物常规麻醉(腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg)。针型记录电极置于前额正中皮下，参考电极置于测试耳后皮下，接地电极置于鼻尖，刺激声为极性交替短声(alternating click)，由TDH49耳机输出，耳机距动物外耳道口1 cm。参数设置：刺激率13次/秒，滤波带宽100～3 000 Hz，叠加1 024次。从90 dB SPL开始观测，按照5 dB的降序依次进行检测，以波Ⅲ出现的最小刺激强度为该动物的ABR反应阈。依次检测每只动物左右耳。

1.2.3基底膜铺片染色 动物经心脏灌注固定(4%多聚甲醛)后，在解剖显微镜下打开听泡，蜗尖挑一小孔，去除镫骨，打开圆窗、卵圆窗，用玻璃吸管从蜗尖和圆窗各处灌注固定，4%多聚甲醛过夜。次日，在解剖显微镜下小心去除耳蜗骨壁，去除螺旋韧带、血管纹，撕去前庭膜，游离各回基底膜，将基底膜置于玻片之上，滴加鬼笔环肽(1:60)，避光染色20分钟。0.01 mol PBS(pH=7.2)缓冲液冲洗3次，基底膜铺片，吸干水分，80%甘油封片，荧光显微镜下观察照相。在毛细胞缺失损伤最严重的部位，放大600倍，连续抽取3个视野计算毛细胞缺失率，取其平均值，如遇视野周边出现不完整的细胞，只记一边，即计左不计右，计上不计下。

1.2.4冰冻切片的制备 心脏灌注4%多聚甲醛后，在解剖显微镜下打开听泡，4%多聚甲醛过夜。10%EDTA室温下脱钙两周，30%蔗糖脱水过夜。10%明胶定向包埋。待明胶完全凝固后，将标本置于冻台，与蜗轴平行平面定位，Lecia恒冷箱切片机连续切片，厚度为10 μm。

1.2.5免疫组织化学染色(ABC法) 制备好的各组织切片晾干后，用0.3%过氧化氢甲醛封闭内源性过氧化物酶，室温30 min；5%BSA山羊血清封闭液室温30 min；抗硝基酪氨酸抗体(1:300)，4 ℃冰箱过夜；生物素羊抗兔IgG室温30 min；SABC室温30 min；DAB显色后苏木精复染。以上步骤中间以0.01 mol/L PBS(pH=7.2)缓冲液冲洗3次，每次10分钟。阴性对照用0.01 mol/L PBS替代第一抗体，其余步骤相同。切片依次脱水、透明、封片。胞核染色呈棕黄色为硝基自由基表达阳性，胞核无着色为阴性，根据棕黄色深浅度定性其表达的强弱。

1.3统计学方法 数据用 SPSS17.0统计学软件处理,各样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1ABR测试结果 各组豚鼠不同时间点的ABR反应阈见表1。

表1 各组豚鼠不同时间点的ABR反应阈

经单因素方差分析显示，各组豚鼠ABR反应阈在噪声刺激前(实验第1天)差异无统计学意义(P>0.05)；噪声暴露后第1(实验第4天)、4(实验第7天)、7(实验第10天)天，各组各时间点之间ABR反应阈比较差异有统计学意义(P<0.01)，噪声+葛根素组在噪声暴露后第1、4、7天的反应阈均低于单纯噪声组(P值均为0.000,P<0.01)。空白对照组各时间点的阈值差异无显著统计学意义(P>0.05)；单纯噪声组第4、7、10天ABR反应阈明显高于其暴露噪声前阈值(P<0.01)，但噪声暴露后各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)；噪声+葛根素组在噪声暴露后各时间点阈值比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.2形态学观察 各组耳蜗铺片见图1。噪声暴露后损伤主要集中在第二回外毛细胞。单纯噪声组各排毛细胞缺失严重，总损失率约为72.65%；噪声+葛根素组外毛细胞损伤较单纯噪声组轻，可见第1、2排毛细胞有所缺失，总损失率约为21.48%；空白对照组外毛细胞排列整齐，无明显缺失。

2.3免疫组织化学法(硝基自由基检测) 单纯噪声组基底膜、螺旋韧带血管纹、螺旋神经节多处出现深棕色着色，过氧化硝基产物生成明显；噪声+葛根素组基底膜、螺旋韧带血管纹着色稍深，螺旋神经节处着色较浅；空白对照组仅血管纹处稍有着色，其余各处未着色(图2)。

图1 三组豚鼠耳蜗铺片

a为单纯噪声组耳蜗第二回，总损失率约为72.65%，各排外毛细胞缺失均较为严重。b为噪声+葛根素组耳蜗第二回，可见第一、二外排毛细胞有所缺失，总损失率约为21.48%。c为空白对照组耳蜗第二回，可见外毛细胞排列整齐，无明显缺失，缺失率约为0%。箭头所示为外毛细胞缺失。(鬼笔环肽染色，各图标尺均为100 μm )

图2 三组豚鼠耳蜗免疫组化染色图片

a单纯噪声组基底膜、螺旋韧带血管纹、螺旋神经节多处出现深棕色着色；b噪声+葛根素组基底膜、螺旋韧带血管纹着色稍深，螺旋神经节处着色较浅；c空白对照组仅螺旋韧带血管纹处稍有着色，其余各处未着色；d.阴性对照 (采用0.01 mol/L PBS替代第一抗体)。实心黑箭头所指位置为基底膜，空心箭头所指位置为螺旋韧带血管纹，十字箭头所示为螺旋神经节。(DAB染色，标尺=100 μm)

3 讨论

研究表明，连续过度的噪声刺激将导致耳蜗内、外毛细胞的损伤或丢失，造成暂时性听觉阈移和永久性听觉阈移。有文献[1]认为噪声性聋后7天听力基本无大幅波动，而噪声性聋的最佳治疗窗口期为噪声暴露后3天[2]，故本实验根据目前常用噪声暴露方式[1,3～5]，在动物噪声暴露前后给予葛根素治疗，并检测实验第1～10天ABR反应阈的变化。结果可见噪声暴露前各组ABR反应阈差异并无统计学意义(P>0.05)，而在噪声暴露后各组动物间ABR阈值差异有显著统计学意义(P<0.01)，单纯噪声组动物ABR阈移达60 dB以上，说明噪声暴露造模成功，动物听力出现了暂时性阈移；噪声+葛根素组较单纯噪声组听力损失程度轻。本结果显示葛根素治疗组在噪声后3天时暂时性阈移最小，这与Yoshimitsu等[5]试验中第3天治疗效果最好的结论一致。说明葛根素对于降低噪声引起的动物暂时性阈移具有一定疗效，并在噪声暴露后第3天发挥了最大效用。

从文中形态学观察发现，4 kHz纯音所造成的损伤多分布在豚鼠耳蜗第二回，与文献报道相符[6]；单纯噪声组各排毛细胞缺失均较为严重，总损失率高达72.65%，而噪声+葛根素组第3排外毛细胞纤毛倒伏但缺失并不明显，第1、2排毛细胞存在部分缺失，总损失率约为21.48%，说明葛根素对噪声暴露致耳蜗损伤有较明显的保护作用。在强噪声的刺激下，盖膜与基底膜之间的剪切力过度增大，使毛细胞的纤毛发生过度的弯曲和偏转，而因为耳蜗底回和第二回主要感知高频声音，基底膜位移幅度最大，因此此处毛细胞受损最为严重，纤毛大幅倒伏，毛细胞缺失比例最大。但葛根素治疗能否减轻噪声所带来的机械损伤尚不明确。

目前噪声性聋的机制并不明确，有学者[7]认为强噪声引起过量自由基产生并引起内耳血流量减少，产生过量自由基使细胞脂质氧化产生异前列烷，进一步加剧血管收缩，引起局部缺血，缺血进一步产生更多的自由基，形成恶性循环。由于自由基产生时间极短，在检测自由基的含量时，一般采取两种方式，一种检测脂质氧化反应中所需酶的含量[8]，另一种就是检测自由基终端产物。曾用于测量氧自由基含量的目的检测因子包括丙二醛(MDA)[8]、异前列烷(8-Isoprostane)[9]、蛋白酶[10]、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)[8,11～13]。本实验室之前也证实一氧化氮(NO)具有自由基性质，极不稳定，易与组织内的O2-互相作用生成过氧亚硝酸根离子[14]。过氧亚硝酸根离子异常活跃，可能是危害性最大的自由基之一，其生成的众多氧化或硝化产物都能反映过氧亚硝酸根离子(ONOO)-的活性，其中的3-硝基酪氨酸可以作为过氧亚硝酸根离子的标志物[15]。从本实验免疫组化染色图片中可见，单纯噪声组在毛细胞、螺旋韧带血管纹、螺旋神经节等部位都有强染色，说明在以上部位有大量强噪声所引起的硝基自由基生成，而噪声+葛根素组以上各处着色明显减弱，螺旋神经节处尤为突出。分析其原因可能为：暂时性阈移的产生可能与耳蜗内环境的突然改变有关，强噪声造成耳蜗机械性损伤的同时，毛细胞发放神经冲动时的电信号以及神经递质出现紊乱，内耳血管痉挛，缺血缺氧，耳蜗内出现大范围脂质过氧化反应。当耳蜗内自由基产量不多，逐步被机体代谢清除后，听力有可能得到恢复；但如果损伤因子过多，不论机械或是化学损伤，使得Corti器毛细胞发生了不可逆性的损伤，可能会形成永久性听力阈移。在本实验中，噪声引起毛细胞出现了不同程度的缺失，这种暂时性阈移很有可能成为永久性阈移。而葛根素本身是一种异黄酮物质，具有还原特性，可以优先清除生成的自由基，避免自由基与细胞膜发生脂质过氧化反应，从而减轻噪声带来的细胞毒性。并且，葛根素具有改善微循环、改善血液流变学特性、抗血栓等作用[16]，最终使毛细胞损伤降低，机械能向生物电能的转换效率较单纯噪声组高，因此葛根素组螺旋神经节处受损程度较轻，且听功能也有改善。

本实验结果显示，葛根素具有清除自由基、拮抗细胞毒性的作用，对提高噪声性聋动物的听功能有一定的作用，在噪声暴露后第3日效果最佳。但与空白对照组比较还是具有显著差异，不能完全保护毛细胞不受损伤，也不能完全逆转或消除已经出现的损伤。

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