HPLC法同时测定阿托伐他汀钙片与普罗布考片中2主分含量

2011-01-09孙成龙韩衍银齐永秀泰山医学院药学院泰安市271016

中国药房 2011年41期

孙成龙，梁浩，韩衍银，李珂，齐永秀（泰山医学院药学院，泰安市271016）

阿托伐他汀钙为选择性3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，能降低血浆胆固醇和甘油三酯水平。普罗布考具有抗氧化作用，能够预防动脉粥样硬化的发生。阿托伐他汀钙与普罗布考联合用药是近几年提出的一种调脂治疗联合方案[1，2]。目前测定阿托伐他汀钙片剂含量的方法主要有紫外分光光度（UV）法、高效液相色谱（HPLC）法和毛细管区带电泳法[3～5]；测定普罗布考片剂含量的方法主要有UV法和HPLC法[6，7]。由于二者在临床联合应用极为广泛，但尚未见同时测定二者血药浓度的有关报道，建立此方法可为临床测定二者的血药浓度提供参考。由于HPLC法专一性强、灵敏度高，但采用外标法，易产生操作误差。为此，笔者选用丹皮酚为内标，建立了同时测定阿托伐他汀钙与普罗布考含量的HPLC内标法。结果表明，此法简便、准确、重复性好，而且节省时间、资源，可以为同时测定二者在制剂中的含量或受试体中的血药浓度提供方法依据。

1 仪器与试药

LC-10AT型HPLC仪、SPD-10A型紫外检测器（日本岛津公司）；N2000双通道色谱工作站、GR-202电子分析天平（日本AND公司）。

阿托伐他汀钙标准品（批号：100590-200802，按三水合物计含量为95.0%）、普罗布考标准品（批号：100560-200301，供含量测定用）、丹皮酚标准品（批号：110708-200505，供含量测定用）均由中国药品生物制品检定所提供；阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司进口分装，批号：138709K，规格：每片10 mg）；普罗布考片（承德颈复康药业集团有限公司，批号：100403077，规格：每片0.25 g）；甲醇为色谱纯，醋酸铵、冰醋酸均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 标准品溶液。精密称取阿托伐他汀钙标准品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为200 μg·mL－1的阿托伐他汀钙贮备溶液。精密称取普罗布考标准品10 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为400 μg·mL－1的普罗布考贮备溶液。分别精密量取2种贮备溶液各2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。

2.1.2 内标溶液。精密称取丹皮酚标准品25 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得质量浓度为500 μg·mL－1的内标溶液。

2.1.3 供试品溶液。取阿托伐他汀钙片20片，研细，精密称取细粉适量（约相当于阿托伐他汀钙10 mg），置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，滤过。精密量取续滤液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得阿托伐他汀钙贮备溶液（浓度约为20 μg·mL－1）。取普罗布考片20片，研细，精密称取细粉适量（约相当于普罗布考20 mg），其余操作及制备浓度同阿托伐他汀钙供试品溶液。分别精密量取2种贮备溶液各2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得。

2.1.4 空白溶液。取处方量的空白辅料，置于50 mL容量瓶中，加甲醇适量充分振摇后稀释至刻度，滤过；精密量取续滤液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。

2.2 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-醋酸铵缓冲液（pH 4.0）＝95∶5，流速为1.0 mL·min－1；检测波长为246 nm；进样量为20 μL。

2.3 系统适用性试验

取“2.1”项下空白溶液及标准品、供试品溶液（加入内标溶液），按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果空白溶液对主成分测定无干扰，理论板数按阿托伐他汀钙峰计不低于1 500，2个主峰与内标峰具有较好的峰形且分离度良好，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白溶液；B.供试品溶液；C.标准品溶液；1.阿托伐他汀钙；2.内标；3.普罗布考Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solution；B.test sample solution；C.reference substance solution；1.atorvastatin calcium；2.internal standard；3.probucol

2.4 线性关系考察

精密量取阿托伐他汀钙贮备溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各精密加入普罗布考贮备溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL及内标溶液2.0 mL，用甲醇稀释制备成含阿托伐他汀钙浓度分别为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg·mL－1，含普罗布考浓度分别为10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg·mL－1的标准曲线工作液，进样20 μL；分别以2组分浓度（X）与二者各自的峰面积与内标峰面积的比值（Y）进行线性回归，得回归方程：阿托伐他汀钙：Y＝0.041 9X+0.017 3（r＝0.999 9，n＝6），普罗布考：Y＝0.037 3X+0.029 6（r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，阿托伐他汀钙、普罗布考检测浓度线性范围分别为5.0～50.0、10.0～100.0 μg·mL－1。

2.5 加样回收率试验

取已知含量的样品，分别精密称取9份，每份准确加入阿托伐他汀钙标准品溶液、普罗布考标准品溶液，制备成高、中、低浓度的溶液，每一浓度3份，按“2.1.3”项下方法制备，并按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.6 稳定性试验

取同一批供试品溶液，在室温下放置2、4、8、12 h，测定峰面积。结果阿托伐他汀钙、普罗布考的峰面积的RSD分别为1.2%、1.1%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 精密度试验

制备阿托伐他汀钙和普罗布考高、中、低（40、20、10 μg·mL－1）3种浓度的溶液各3份，加入2 mL的内标溶液，分别在当日内重复测定3次和3 d内重复测定3次，以测得的阿托伐他汀钙峰、普罗布考峰与内标峰面积之比计算方法的精密度。结果阿托伐他汀钙日内RSD＜0.96%（n＝3）、日间RSD＜1.99%（n＝3）；普罗布考日内 RSD＜0.56%（n＝3）、日间RSD＜1.54%（n＝3）。