髓核内注射转化生长因子-β1对兔软骨终板Ⅱ型胶原表达影响的实验研究

马 骁，杨学军，霍洪军，卡 索，刘 成

腰痛是骨科及疼痛科门诊中较常见的疾患。腰椎间盘退变是引起腰腿痛的主要原因，其确切的发生机制仍不十分清楚，但普遍认为软骨终板退变是腰椎间盘退变的基础环节［1］。本研究通过制作椎间失稳导致软骨终板退变的家兔模型，并通过髓核内注射转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制炎性因素作用等方法预防软骨终板退变，为椎间盘退变的预防和早期治疗提供新的思路和途径。

材料与方法

1 动物及分组

选用36只6月龄日本大耳白兔(由内蒙古农业大学动物实验中学提供)，雌雄不限，体重为(2.5±0.2)kg，均在相同条件下饲养。随机分为对照组和预防组。对照组18只(2只备用)，预防组18只(2只备用)。

2 方法

所有实验动物的手术操作均由1个人完成，通过剥离骶棘肌、切断L5/6、L6/7棘上、棘间韧带、关节囊及两侧关节突关节后外1/2造成L5/6、L6/7椎间失稳模型。预防组动物在完成椎间失稳手术后立即于同一切口通过侧后方入路显露L5/6、L6/7椎间盘，并行髓核内注射TGF-β1。

2.1 椎间失稳手术:将全部实验动物36只日本大耳白兔均行椎间失稳手术，将其腰背部皮毛剪除至清洁，用安定注射液1.25mg/kg、氯胺酮0.02g/kg、阿托品0.125mg/kg顺次耳缘静脉注射麻醉后，俯卧固定于手术台上，1%碘伏消毒手术区域，铺无菌手术巾，以髂嵴平对椎间隙(即L6/7)为中心，从正中纵行切口长约4cm(预防组动物取正中偏左侧弧形切口，长约6cm)，切开皮肤及皮下组织，锐性分离，暴露棘突、椎板及上下关节突，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开，然后依次切除L5/6、L6/7棘上、棘间韧带、关节囊，咬除L5、L6椎体下位后外1/2小关节突，造成椎间失稳，用无菌生理盐水冲洗切口，依次缝合各层组织。

2.2 侧后方入路髓核内注射:术前准备及麻醉同椎间失稳手术。动物取右侧卧位，以髂嵴平对椎间隙(即L6/7)为中心，取正中偏左侧弧形切口长约6cm。切开胸腰筋膜后层，在骶棘肌和腰方肌的外缘与胸腰筋膜前层间钝性分离。近腰方肌前内缘可触及横突，剪断L6左侧横突。剪开胸腰筋膜前层，可见腰大肌，用神经剥离子纵行分开，即可显露L6椎体和L5/6、L6/7椎间盘。椎间盘呈扁平盘状，稍膨出，白色有光泽，用7号注射针头穿刺确认椎间盘，用1ml注射器刺入纤维环，有突破感后(深度约5mm)注入 1mg/ml的 TGF-β125 ～30μl［2］。

术后动物均分笼饲养，笼中自由活动。对照组1只兔切口感染(3周后自然愈合);预防组1只兔深部感染(形成深部脓肿)，1只兔于术后第2天死亡。于术后第3、6个月各取8只取材。

2.3 检测指标

标本进行苏木精-伊红(HE)染色进行组织学观察。软骨终板Ⅱ型胶原表达的测定采用常规免疫组化SP染色法，将免疫组化染色后的每个标本在高倍镜下随机选取不重叠10个视野，对每个视野中的Ⅱ型胶原进行灰度值检测，用JD8Ol图像分析系统进行图像分析。根据不同染色部位的灰度值自动计算阳性细胞的平均灰度，以灰度值代表Ⅱ型胶原表达情况(灰度值与阳性物质含量呈反比)。

2.4 统计学处理

分别对预防组与对照组术后3、6个月结果采用独立样本t检验处理，所有数据输入计算机，以SPSS 15．0统计软件分析，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

结 果

1 软骨终板组织形态学观察

对照组标本术后3、6个月软骨终板退变明显，并且逐渐加重。经过髓核内注射TGF-β1，预防组标本在术后3、6个月未发现软骨终板明显退变现象(图1～4)。

2 对照组与预防组软骨终板中Ⅱ型胶原的表达

高倍镜下观察，软骨终板中Ⅱ型胶原呈棕色，显色对照组标本术后3、6个月软骨终板内Ⅱ型胶原表达稀疏、排列欠均匀，并且逐渐加重。经过髓核内注射TGF-β1，预防组标本在术后3、6个月未发现软骨终板内Ⅱ型胶原表达较密集、排列紧密明显减少(图5～8)。

软骨终板中Ⅱ型胶原的表达经过髓核内注射TGF-β1，椎间失稳术后3、6个月预防组与对照组标本软骨终板Ⅱ型胶原免疫组化染色图像分析测定灰度值结果见表1。

表1 软骨终板内Ⅱ型胶原表达灰度值

软骨终板中Ⅱ型胶原在对照组椎间失稳状态下各实验时间点短期内软骨终板中Ⅱ型胶原含量明显减少，变化是明显的，统计学上有极显著性差异(P＜0.05=0.000)。预防组自然增龄进程中各实验时间点短期内无明显变化，统计学上无显著性差异(P＞0.05=0.302)。术后3个月预防组与对照组比较灰度值较低，统计学上有显著性差异(P＜0.05=0.044)。术后6个月预防组与对照组比较灰度值明显较低，统计学上有极显著性差异(P＜0.01=0.000)。

图1 对照组术后3个月，少量簇聚的软骨细胞，细胞排列不规则潮线不清(HE×40)

图2 预防组术后3个月，软骨细胞分布均匀，无簇聚软骨细胞;潮线清晰;染色均匀(HE ×40)

图3 对照组术后6个月，细胞排列紊乱，有大量簇聚软骨细胞，软骨钙化层明显增厚，潮线模糊、断裂;染色不均匀(HE ×40)

图4 预防组术后6个月，表层略不平整，软骨细胞分布均匀，无簇聚软骨细胞;潮线清晰;染色均匀(HE ×40)

图5 对照组术后3个月，Ⅱ型胶原表达稀疏、排列欠均匀(免疫组化 ×100)

图6 预防组术后3个月，Ⅱ型胶原表达较密集、排列紧密均匀(免疫组化×100)

图7 对照组术后6个月，Ⅱ型胶原表达稀疏，有裂隙出现，排列不均匀，有失染现象(免疫组化 ×100)

图8 预防组术后6个月，Ⅱ型胶原表达较密集、排列尚均匀(免疫组化 ×100)

讨 论

1 软骨终板退变在椎间盘退变中的作用

正常椎间盘由纤维环、髓核和软骨终板组成。软骨终板内除软骨细胞外还含丰富的细胞外基质，主要包括水、胶原和蛋白多糖等。软骨终板退变将导致3种主要物质胶原、蛋白多糖和水的改变［3］。从力学上看，蛋白多糖能抵抗压应力，而胶原能抵抗张应力［4］，两者相互配合，以保持软骨终板良好的力学性能。

软骨终板是位于椎间盘与椎体之间一层薄的透明软骨，平均厚度1mm。软骨终板直接与椎体骨髓血窦接触，椎间盘营养物质转运主要通过血窦－软骨终板界面进行。因此软骨终板途径是椎间盘主要的营养途径［5］。在椎间盘退变过程中，常伴随着软骨终板的损伤、增厚、钙化或者骨化。随着软骨终板的增厚、钙化及其骨化，血窦－软骨终板界面弥散营养物质的能力将受到严重影响，进一步导致椎间盘营养障碍，从而加重或加速椎间盘退变的发生，因此软骨终板在椎间盘的营养代谢方面发挥着极其重要的作用。以上观点已被许多临床和实验研究所证明［6］。

2 细胞因子对软骨终板的作用

软骨终板在生理状态下，软骨细胞的分解代谢和合成代谢处于平衡状态，同时软骨细胞的这种平衡状态在维持成熟软骨细胞外基质结构和功能中也起到主要作用。这种分解与合成活动的平衡受到细胞因子的驱使。细胞因子由造血系统、免疫系统或炎症反应中活化细胞产生一种激活型多功能多肽、蛋白质或糖蛋白。根据其调节软骨细胞的不同功能可分为:分解性细胞因子、调节性细胞因子、抑制性细胞因子和合成性细胞因子。细胞因子发挥着调节细胞分化增值和诱导细胞发挥功能的作用，是调节细胞之间相互作用的主要因子。

本实验讨论的TGF-β1属于合成性细胞因子，能抵消许多白细胞介素-1(IL-1)的影响，在软骨维持及软骨损伤修复中起重要作用。IL-1通过刺激软骨细胞可以产生包括能破坏软骨的大多数蛋白水解酶，如刺激组织金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)产生，抑制组织金属蛋白酶(tissue inhibitor of metalloproteinas．es，TIMP)产生，导致 MMPs和TIMP比例失调，最终引起软骨细胞外基质破坏。TGF-β1具有对抗IL-1对软骨细胞产生上述影响的作用，同时未发现其协同作用。因此，TGF-β1用于维持和修复损伤软骨逐渐成为研究热点。

3 侧后方入路椎间盘内注射方法的优点

关于抑制和治疗椎间盘退变的给药途径主要包括局部给药、腹腔给药等，腹腔给药经大网膜吸收后经肝、肾等器官代谢，同时椎间盘是一个密闭系统，几乎无血管供应，软骨终板的被动扩散是其主要营养途径，所以局部直接注射已成为首选的给药途径。既往椎间盘内注射主要通过前侧入路，由于兔和人解剖学特点的差别，很难完整剥离沿腹膜后显露椎体及椎间盘。同时前侧入路创伤大，对腹腔脏器干扰大，动物无法有效进行胃肠的术前准备和术后护理，术后并发症较多，影响实验效果。南方医科大学王非等［2］于2003年提出侧方入路于骶棘肌和腹斜肌间显露椎间盘注射的方法，有效避免了上述情况的发生。本次实验，由于实验动物需行椎间失稳手术，我们改良了侧方入路椎间盘注射的方法，采取侧后方弧型切口，完成椎间失稳手术后，于同一切口经后外侧切开腰背筋膜后层，经骶棘肌和腰方肌的外缘与胸腰筋膜前层间钝性分离至L6横突，剪断L6左侧横突，纵行分开腰大肌后可显露 L6椎体和L5/6、L6/7椎间盘。经过侧后方入路椎间盘注射的方法不仅避免损伤腹腔脏器，而且经过髂嵴横突可准确定位腰椎节段，显露L5、L6椎体和 L5/6、L6/7椎间盘充分;操作简便，普通器械可完成;损伤较小，且可于椎间失稳造模术共用同一切口，避免再次创伤的优点。侧后方弧形切口定位显露1～2个椎体及椎间盘较为方便有效，但如果需要一次性显露3个或3个以上椎体及椎间盘，采取侧方入路可能更为有效。

4 TGF-β与软骨组织维持的相关性

软骨终板属透明软骨，软骨细胞必须终生维持未分化的状态并保持良好的胞外基质分泌功能才能保证脊柱的正常生理功能。软骨终板还必须抵御各种各样的损伤因素，如压力、创伤、炎症、异常代谢等，并自身调整建立新的平衡，维持软骨的未分化状态，否则将导致软骨的消耗、侵蚀、钙化，进一步限制营养物质的交换，导致椎间盘等退变［7］。

TGF-β信号对于维持软骨终板具有很重要的作用。TGF-β信号与软骨细胞的发育成熟密切相关［8］，同时能维持软骨细胞处于未分化状态，抑制肥大分化。TGF-β的表达和功能随着年龄在关节、终板软骨中逐渐衰退［9］。另有实验发现IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)这些炎症细胞因子能抑制关节软骨细胞中TGF-β信号的功能，TGF-β1的应用则可以对抗IL-1诱发的软骨损伤，提示TGF-β信号在骨关节炎症疾病进程中的联系［10］。TGF-β1还可通过抑制可降解软骨基质的各类组织蛋白酶的表达来保护软骨，如可通过细胞磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路诱导TIMP的表达来抑制关节软骨的降解［11］。这些都有可能是TGF-β信号维持关节及终板软骨未分化状态的机制。TGF-β1分子作为药物治疗人类由于软骨退变造成的一系列疾病已成为新的研究方向［12］。

本实验显示，随着造模时间的延长，由于长期椎间失稳的异常应力负荷，对照组动物软骨终板内Ⅱ型胶原消耗，软骨细胞排列紊乱，部分细胞核固缩、碎裂、溶解，软骨钙化层增厚导致软骨终板明显退变。而预防组动物由于椎间失稳造模同时行髓核内注射TGF-β1，术后3、6个月软骨终板组织学表现及软骨内Ⅱ型胶原表达情况均明显优于对照组动物。提示TGF-β1在椎间失稳的异常应力负荷作用时可预防软骨终板钙化、退变，从而保障椎间盘的营养代谢，延缓椎间盘退变。本实验虽然显示了TGF-β1软骨终板退变的预防作用，但不可否认，个别标本显示对软骨终板退变预防作用并不十分明显，这可能由于椎间失稳后，脊柱的异常负荷长期存在，虽然髓核内注射TGF-β1可预防软骨终板退变，但由于致病因素长期存在，我们采用的注射剂量及给药时机、途径也只是一种尝试性的研究，更详细、更有针对性的研究将继续进行。

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