耐热型复合乳酸菌冻干保护剂的研究

孙盈，黄金海，李莹，贾程坤，高嵽，刘阳，鲁珂成

（天津大学化工学院，天津 300072）

耐热型复合乳酸菌冻干保护剂的研究

孙盈，黄金海，李莹，贾程坤，高嵽，刘阳，鲁珂成

（天津大学化工学院，天津 300072）

为获得对于混合乳酸杆菌最佳的耐热冻干保护剂配方，考察了不同冻干剂单因子添加物及5种冻干保护剂配方对冷冻干燥后乳酸菌的存活率、耐热性能，失水情况和感官指标，利用中心组合响应曲面法设计，获得以活菌率，耐热性和失水率为控制指标的保护剂组分优化的多元二次方程，并进行显著性分析。结果表明，通过初步筛选获得感官良好、复溶后相容性好的冻干介质，进一步条件优化得到最佳配方。最佳冻干保护剂配方为脱脂乳10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5%，海藻糖5%，维生素C为0.5%（均为质量分数），此时冻干后活菌率的预测值可达到93.05%，37℃保存10 d后活菌率预测值可达到77.26%，具有较好的耐热性能。

乳酸菌；冻干保护剂；中心组合设计；耐热性

0 引言

近年来，随着人们消费水平的提高和健康理念的改善，发酵乳制品的关注度不断得到提升，直投式酸奶发酵剂因其活力强、含菌量高、菌量稳定，保存期长、耐储运，使用方便，发酵产品稳定等优点而成为了研发热点[1]。作为提升发酵剂活力的关键工艺，冻干保护剂能有效防止细菌细胞死亡，保证活菌量和延长菌种保藏期。我国酸乳市场广阔，研制满足规模化及自制酸乳等多元化市场需求，适应不同冷链流通的耐热冻干保护剂酸乳菌种具有重要意义[2，3]。本文通过活菌计数，耐热性，冻干剂外观及相容性评价等指标的分析，对复合冻干保护剂配方进行筛选研究，以期为发酵剂的工业化生产提供依据[4，5]。

1 实验

1.1 材料

保加利亚乳酸杆菌A株，嗜热链球菌S株，嗜酸乳杆菌CL10株，鼠李糖乳酸杆菌L3株，均由本实验室分离保存。

质量分数为20%脱脂乳，MRS液体培养基，HHD固体培养基，灭菌0.5%NaCl溶液，按文献配制；蔗糖，海藻糖，明胶，谷氨酸钠，维生素C，聚乙二醇（PEG6000），聚乙烯吡咯烷酮（PVP30），山梨醇均为生物纯或化学纯。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培养

将37℃过夜培养的乳杆菌、嗜热链球菌、CL10及L3菌培养物，以终浓度2%分别接种含1%脱脂乳MRS液体培养基，37℃培养24 h后分别取样进行活菌计数。其余培养菌分别以5 000 r/min离心10 min，菌泥称重后加入适量MRS悬浮，再按一定体积比混合制备复合乳酸菌剂。

1.2.2 复合乳酸菌保护剂效果的检测

设置不同的冻干剂组方，将上述菌液与不同冻干剂等体积混合，混匀后分装于青霉素瓶中，每瓶2 mL,每组5个重复。各组样品置-40℃的冰箱中预冷4 h，然后于预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥16～18 h。冻干过程中观察不同冻干剂组水分升华快慢情况，待全部样品冷冻干燥充分后，取出样品，进行失水率及活菌计数等指标的测定：

（1）冻干后失水率Y3=（冻干前菌质量-冻干后菌质量）/冻干前菌质量×100%；

（2）冻干后活菌率Y1=冻干后菌数/冻干前活菌数×100%；

（3）各组样品置37℃温箱放置10 d后进行活菌计数，计算耐热处理后的活菌率Y2，Y2=37℃，10 d后活菌数/冻干前活菌数×100%；

（4）冻干菌粉外观感官指标评价分级如表1所示。

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表1 冻干菌粉感官评分标准

冻干菌粉感官评价总分为30分：得分24分以上为优质冻干菌粉，27分以上为特优，20分以上到24分为良好冻干乳粉，16分以上至20分为合格冻干乳粉，16分及以下为劣质冻干乳粉。

1.2.3 耐热冻干保护剂筛选

（1）在以质量分数为3%脱脂乳MRS的基础上，分别选择加入7%的PEG6000，7%的PVP30，2%～4%甘油，10%淀粉，7%谷氨酸钠作单因素冻干剂实验，使总菌量达3×1013mL-1，冷冻干燥后，感官指标评价选择外观，复溶性快速、均匀的原料做进一步研究。

（2）几种复合保护剂的相容性比较。保护剂配方：保护剂A（10%脱脂乳和8%蔗糖，均为质量分数），保护剂B（8%脱脂乳、2.4%明胶、2%海藻糖、5%蔗糖，均为质量分数），保护剂C（10%脱脂乳，5%海藻糖，1%谷氨酸钠，2%维生素C，均为质量分数），保护剂D（8%脱脂乳，7%聚乙烯吡咯烷酮，2%海藻糖，5%蔗糖，0.2%山梨醇，均为质量分数），保护剂E（10%脱脂乳，5%葡萄糖，1%谷氨酸钠，2%维生素C，均为质量分数）。

（3）几种添加物对耐热冻干保护剂的影响。参考前期5种复合保护剂的综合评价情况，选择脱脂乳、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、维生素C（Vc）4个因素、3个水平，其他固定添加因子分别为4%蔗糖、1%葡萄糖和1%谷氨酸钠，利用软件Design-Expert 8.0.4，选择响应面分析法(Response Surface)的中心组合设计(Central Composite Design)进行方案设计和试验实施。

中心组合方式(Face Centered)α=1.0。回归模型为二次方程形式。通过冻干后活菌率Y1,37℃放置10 d后活菌率Y2，冻干后失水率Y33个指标的比较，评价耐热冻干保护剂的效果。选择以获得冻干后活菌率Y1，耐热处理Y2为主要评价指标，在等权重系数时，根据Design Expert软件最优解计算法，获得修正后的最佳耐热冻干保护剂理想组方。

2 结果

2.1 不同乳酸菌的培养

将培养的保加利亚乳酸杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳酸杆菌分别离心，菌泥称重，MRS悬浮后，按适当的活菌比，配制成总菌量为12×1013mL-1备用。

2.2 不同单因素添加物对冻干外观的影响

单因素试验中，添加7%PEG6000，PVP30，甘油后的实验组，冻干过程明显延长，而且冻干后样品聚缩在一起，难溶性增加；添加淀粉的冻干样品，均一性，色泽较佳。

2.3 5组复合保护剂的结果比较

不同保护剂冻干菌的失水率如图1所示。

由图1可以得出，冻干菌粉失水率比较B＞A＞C＞E＞D。冷冻过程中观察冻存瓶的水分升华线得到干燥速度的顺序为E＞D＞A≈C＞B。

冻干菌粉感官指标如表2所示。由表2可以看出，冻干菌粉外观综合比较为A＞B＞D＞E＞C。

表2 冻干菌粉感官指标评分

活菌记数结果如表3所示。由表3可以看出，冻干后菌种活率比较E＞C＞B＞A＞D；37℃保存10 d后菌种活率比较为D＞C＞A＞B＞E。

表3 冻干及耐热处理后活菌记数结果

表4 中心组合实验设计及结果%

2.4 不同添加物对耐热冻干保护效果的影响

实验设计结果如表4所示。

利用Design Expert软件对冻干保护剂响应曲面设计试验的实测值与预测值进行二次多项回归拟合，获得冻干后活菌率（Y1）、37℃10 d后活菌率(Y2)以及失水率(Y3)的预测值对自变量脱脂乳(A)、海藻糖(B)、PVP(C)和Vc(D)的多元回归方程分别为

由表5可以看出，除冻干后活菌率指标方程差异显著外，37℃（10 d）后活菌率和失水率指标方程差异均为极显著，说明3个指标与所选因素之间存在显著的回归关系。PVP的加入，对乳酸菌冻干过程的成活率，耐热性及冻干的失水率都有显著影响。在耐热性方面，不同添加物之间有较显著的影响，适量Vc的加入有助于改善乳酸菌保护剂的耐热性能。

以获得冻干前后活菌率、37℃处理10 d后耐热性为主要指标，等权重条件下获得了修正后的最佳耐热冻干保护剂组方：脱脂乳10%，PVP5%，海藻糖5%，维生素C 0.5%（均为质量分数），此时冻干后活菌率的预测值可达到93.05%，37℃保存10 d后活菌率预测值可达到77.26%。

3 讨论

发酵酸乳市场需求大，优良及高活菌率的直投式乳酸菌菌种的研究成为热点。食品耐热冻干保护剂的研究，除具有良好的外观、冻干组分安全无毒，加水后复溶性好等优点外，保持冻干后高活菌率及活菌维持时间，即具有良好的耐热性能，才能满足理想冻干保护剂的要求。本研究所选用了作用机制不同的冻干保护剂组分，从冻干后外观，复溶能力，冻干菌粉的持水性能，冻干后活菌率，冻干菌耐热性能等方面探讨冻干剂组分的相互作用，并筛选优化复合乳酸菌冻干组方。

研究中选用了天然及合成的高分子物质，脱脂乳、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，它们在冻干生物制品中主要起骨架作用，使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加[8]；大分子明胶、聚乙烯吡咯烷酮具有很强的亲水特性和氢键形成能力，利用其氢键和亲水基形成一个稳定的水分子层，阻碍膜内结合水向外转移，保护了细胞的结构[5]，谷氨酸钠和高蛋白含量可显著提升冻干过程细菌的存活率。小分子糖、醇的加入可提高干燥升华速度[7]，缩短冻干时间。但研究中发现过高浓度的小分子糖醇又会导致冻干制品表面起泡、不平整；过高浓度的PVP、PEG等高分子物质，可显著地延缓干燥过程，冻干制品的终含水量也较高。研究也表明，添加海藻糖可显著提高冻干菌的耐热性能，延长保存期。Hubel[9]和Zayed[10]分别从“玻璃体学说”和“水替代假说”角度表明海藻糖分子能减少保存以及复水过程中细菌细胞的死亡，具有明显的增强耐热的功能。

表5 实验结果的方差分析

4 结束语

在保证外观及良好复水性能的基础上，进一步通过不同添加物的正交优化实验，利用中心组合响应曲面分析，通过冻干后活菌率、37℃（10 d）保存后的活菌率的评价，可获得最佳的冻干保护剂配方为脱脂乳10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5%，海藻糖5%，维生素C为0.5%，此时冻干后活菌率的预测值可达到93.05%，37℃保存10 d后活菌率达77.26%。

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Study on freeze-drying protectant formula with heat-tolerance of complexLactic acid bacteria

SUN Ying,HUANG Jin-hai,LI Ying，JIA Cheng-kun,GAO Die,LIU Yang,LU Ke-cheng
(School of Chemical Engineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China)

Aim:Effect of different additions was to be analysed and optimal freeze-drying protectant formula with heat-tolerance of comolexLactic Acid Bacteriastrains(LABs)was to be obtained.Method:Detection of bacterial livability,heat-tolerance,driage and oranoleptic indicator among five freeze-drying protectant formulas and different additives was performed.Then the central composite response surface was employed to obtain the multiple quadratic equations on bacterial livability,heat-tolerance and driage and significant analysis.Result:The protectant medium with good organoleptic property and redissolved compatibility was screened preliminarily.Furthermore,the optimal formula was obtained.Conclusion:The optimal cryoprotectant with 93.05%predicted livability and high heat-tolerance was obtained with 10%skimmed milk,5%polyvinylpyrrolidone(PVP),5%trehalose,and 0.5%Vitamin C.

lactic acid bacteria,freeze-drying protectant,central composite，heat-tolerance

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）04-0012-04

2011-01-14

天津市应用基础及前沿技术研究计划项目（08JCZDJC22600）。

孙盈(1988-)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

黄金海