微小果核上人体脱落细胞DNA检验

郑绍军,李 静,曾 丽,赵彩云

(广安市公安局刑事科学技术研究所,四川 广安 638000)

微小果核上人体脱落细胞DNA检验

郑绍军,李 静,曾 丽,赵彩云

(广安市公安局刑事科学技术研究所,四川 广安 638000)

本文作者结合实际检案工作对微小果核上微量脱落细胞采用直接剥离果核种皮、剪碎、浸泡、反复多倍纯水稀释、震荡、离心收集脱落细胞,通过固液分离、超纯水清洗、离心等手段消除一些PCR的抑制因素,采用Chelex法联合Q IAGEN试剂盒联合提取纯化浓缩DNA模板,适当增加PCR循环数,明显提高了微小果核上微量脱落细胞的检出成功率。

法医物证学;微小果核物证;DNA检验;微量脱落细胞

在现代犯罪行为中,现场物证呈现出多样化、微量化的发展趋势。在笔者接触的多起杀人、盗窃案件中,果核均成为案发现场提取的唯一生物检材。微量生物检材上粘附的脱落细胞数量有限,使得现场的PCR抑制因素更加突出,因此在提取微量生物检材上脱落细胞时应尽量多收集,至少达到足够一次PCR的细胞量。目前提取果核上脱落细胞常采用双棉签法或丝线擦拭法。该方法主要是针对体积较大的果核,对桔子、柚子核等微小果核提取效果较差。笔者结合一例入室抢劫杀人案介绍微小果核上人体脱落细胞DNA检验。

1 案例资料

2009年12月,四川某县江某(男,78岁)被杀死在自己家中。在死者家2楼及3楼堆放的油菜秆中提取桔子核及皮若干。实验室受理后,将剥下的桔子核种皮剪碎、浸泡、反复多倍纯水稀释、震荡、离心收集脱落细胞,采用chelex法联合Q IAGEN试剂盒提取检验,获得完整DNA图谱。经比对分析,桔子核种皮上脱落细胞DNA分型与嫌疑人一致。

2 试剂及仪器设备

试剂:5%Chelex-100(5g 200-400目的Chelex-100 100ml超纯水)、PK10mg/ml、Q IAGEN试剂盒、Sinofiler复合扩增试剂盒。

仪器:3130型基因分析仪、9700型PCR扩增仪。

3 检材情况

所送现场提取得桔子核共7粒,外表较干燥,不同程度粘附有柴草、灰尘、沙砾。

3.1 DNA提取:方法1:取2粒桔子核,用干棉签轻轻拭掉上面的灰尘、草屑,然后先用适度湿润的纱线用力擦拭果核表面一遍,再用干纱线再用力擦拭一遍。将两次擦拭纱线置于1.5mlEP管内,采用《GA/T383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》中chelex法处理,加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK,使之终浓度达到200ug/ml,56℃消化60分钟以上,100℃煮沸8分钟;震荡后13000rpm离心5分钟,4℃保存备用。

方法2:取2粒桔子核,用干棉签轻轻拭掉上面的灰尘、草屑,剥除桔子核种皮,剪碎,置入1.5mlEP管内,纯水1000ul浸泡15分钟以上,期间吹打并高速震荡,13000r/min离心5分钟,去上清。再次加入纯水1000ul稀释高速震荡,13000rpm离心5分钟,重复该操作3-5次。采用chelex法处理,加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK,使之终浓度达到200ug/ml,56℃消化60分钟以上,100℃煮沸8分钟;震荡后13000rpm离心5分钟,4℃保存备用。

方法3:取2粒桔子核,处理方法同方法2。取chelex法处理后的DNA上清液(全部吸尽,尽量不要吸到珠子),使用Q IAGEN试剂盒中的PB I溶液按体积比5∶1充分混匀,以13000rpm离心过柱子,弃掉下层液体,重复此操作直到混合液全部滤过,加已配无水乙醇的PE洗涤液500ul,离心洗涤1次,将65℃预热的EB洗脱液30ul直接加到纯化柱的硅膜上,13000rpm离心2分钟,4℃保存备用。

3.2 PCR扩增与检测:分别取以上三种方法得到的模板DNA,采用10ul扩增反应体系,其中Reaction Mix 1.0ul,Gold Tag酶0.3ul,Primer set 1.0ul,模板DNA 1.0ul、1.75ul、2.5ul梯度扩增,用超纯水补足体系。根据Sinofiler复合扩增试剂盒说明书设置,置于9700型PCR扩增仪扩增。

扩增产物经3130型基因分析仪电泳收集信息,用GeneMapper ID v3.3进行等位基因分析。

3.3 结论:按照方法1处理桔子核未能得到STR基因座分型图谱,按照方法2处理桔子核未能得到全位点STR基因座分型图谱(图一),按照方法3处理桔子核检出全部STR基因座分型(图二)。

4 讨 论

4.1 检材的收集:从载体上提取人体脱落细胞DNA的含量合纯度,受个体差异、与载体接触时间、载体性质等诸多因素的影响[1]。桔子核属于微小果核,果核上脱落细胞量较少,用棉签或纱线擦拭往往不能得到足够量的DNA模板,为此笔者采用将果核种皮剥离剪碎浸泡以收集足够量的脱落细胞,但因受果胶、果酸的影响,刚开始浸泡液十分粘稠,其比重大于细胞,故直接离心不能使脱落细胞沉淀,需要反复多倍纯水稀释震荡离心。这是收集脱落细胞的关键。

4.2 检材DNA提取:Chelex法提取微量生物检材上细胞DNA的优点是操作方便,步骤简单,整个提取过程在一个离心管中完成,减少了污染的机会,但是单用Chelex法提取缺点也十分明显,即不能浓缩纯化DNA,尤其对微量生物检材提取成功率低,如上述方法1、2,均未能得到满意的DNA STR分型。笔者先采用Chelex法提取微量检材DNA,既可以提取到较多量的模板DNA,又可通过固液分离、超纯水清洗、离心等手段初步消除一些PCR的抑制因素,在Chelex法提取基础上加用Q IAGEN试剂盒往往成功检出微量检材DNA STR分型。

4.3 扩增反应及检测:在提取咬过的水果、吃过的果核时,因受果胶、果酸的影响,可以用chelex-100配合Q IAGEN试剂盒提取,建议用25μL全体系扩增,扩增时适当增加2-4个循环,循环数不要超过32个,否则会出现非特异性扩增或漏扩增,影响结果判定。对微量DNA进行分析,由于DNA含量少,且受载体介质影响,结果产生不对称扩增、等位基因丢失或增加等问题,甚至被污染,所以要结合比对对象,确定结果是否可采用,无比对对象检材要进行重复试验,基因型相同时才可确定[2]。

4.4 质量控制:严格防范在现场勘查或送检过程中的检材污染[3],尽可能将相关人员的DNA数据放入质控库。严格执行《法庭科学DNA检验规范操作标准》(GA/T383-2002),避免试验室内污染。实验中必须设置阳性对照、阴性对照及试剂对照,以保证检验结果准确性。

[1] 郭燕霞,陈 松,刘开会,等.人体脱落上皮细胞DNA检验2例[J].刑事技术,2007,(1):51-52

[2] 陈 松,李万水,胡 兰,等.微量DNA:容易忽略的生物物证[J].刑事技术,2004,(1):19-21

[3] 胡 兰.法医遗传学进展与应用[M].北京:群众出版社,2008.29-32

1005-3697(2011)03-0260-02

DF795.4

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2011-04-22

(学术编辑:杜 冰)