疑难生物检材DNA的检验探究

刘 鑫

山东警察学院 山东省济南市 250014

疑难生物检材DNA的检验探究

刘 鑫

山东警察学院 山东省济南市 250014

疑难生物检材根据类型的不同可分为微量DNA检材，DNA降解检材，DNA抑制剂含量超高的检材以及混合DNA检材。本文对这四种常见的疑难生物检材DNA的检验方法进行了探究，并介绍了一种新的用在DNA抑制剂含量超高的检材中的SCODA电泳提取纯化技术。

疑难生物检材；DNA微量检材；降解DNA检材；DNA抑制剂含量超高的检材；SCODA

经过20多年法医工作人员的实践和不断努力，PCR-STR复合扩增技术已逐渐成为了法医DNA的常规检测方法，它具有灵敏度高、分辨率高等特点，在实践中发挥了极其重要的作用，为侦查破案提供了强有力的线索和证据。

但随着社会的不断发展与进步，犯罪分子的反侦察能力、作案手段不断提高，出现了许多在现有技术检测方法基础上无法很好解决的一些问题。如在“两抢一盗”案件中，经常出现的如手套、面罩等脱落细胞类的微量物证等；以及在强奸案中出现的混合精斑等；以及在无名尸案件中出现的腐烂组织等；还有受各种抑制剂所影响DNA的提取、扩增等的疑难检材等等。

通常情况下，我们将这些使用常规检验技术无法或难以得到理想实验结果的生物检材，称之为疑难生物检材。按照类型的不同，它可以分为：

（1）微量DNA检材；（2）DNA降解检材；

（3）DNA抑制剂含量超高的检材；（4）混合DNA检材。

1 微量DNA检材

微量DNA检材又称为低拷贝检材（low copy number，LCN），它是指DNA含量少于100pg，相当于15个双倍体或30个单倍体细胞中的DNA量[1]。

微量DNA检材，通常来源于犯罪分子接触过的日常用品、衣物、作案工具等。根据罗卡定律（Locard exchange principle），“凡是两个物体接触，必然会产生转移”[2]，那么凡是与人体接触了，接触部位就会留下人体的脱落细胞。目前，随着犯罪分子的反侦察意识越来越强，致使我们越来越难在现场发现提取到如血迹或血斑、精液或精斑、唾液或唾液斑等一系列的“显而易见”的生物检材。那么这些具有隐蔽、体积小、不易发现等特点的微量检材则成为了破案的关键所在。但由于微量检材中的DNA含量较少，所以保证DNA的提取效率以及DNA的有效使用效率是此类检材检验的关键。

那么，现阶段针对微量DNA检材的解决方案主要有[3]：

（1）增加PCR的循环数；

（2）通过各种商业化的试剂盒进行纯化浓缩；

（3）扩增后产物DNA的纯化技术；

（4）全基因组的扩增技术；

（5）激光捕获显微切割技术；

（6）巢式PCR技术；

（7）SNP技术及mini-STR检材体系的应用；

（8）使用高纯度的甲酰胺及改变相应的电泳条件；

（9）低体积的PCR扩增技术。

此外，大量的一线工作者在不断的实践探索中也找到了一些针对微量检材提取较为成功的方法。董迎春等人4回顾性分析了2012年以来的1025例涉案手机和电脑接头类检材的DNA检验情况，证实了他们所使用的改良硅珠法具有便捷、省时、高效、检验效果理想等特点，可以较好的适用于法医微量物证DNA的检验。其中这里的改良硅珠法，它使用了具有过滤杂质功能的离心套管，降低了硅珠悬浊液的使用量，简化了漂洗步骤，并使用小体系的洗脱液进行洗脱等等。这些步骤不仅简化了实验操作，而且降低了DNA的损耗，并最终提高了DNA的浓度。

2 DNA降解检材

当生命体新陈代谢停止后，如果生物检材在外界环境下长时间的暴露，细胞内的DNA会因为光照、湿度以及微生物等各种物理、化学、生物作用而发生降解，使DNA分型成功率显著降低。

而现在随着犯罪分子的反侦察意识的不断增强，作案手段的不断提高，人为的导致生物检材降解的可能性越来越大，比如掩埋、焚烧、沉湖、化学试剂浸泡等等一系列作案手段，都给DNA的提取检验工作带来了巨大的挑战。

一般来说，影响生物检材降解的因素主要有[3]：

（1）温度。温度是影响生物检材降解的最重要的因素。温度每升高20℃，生物大分子的降解速率提升10～25倍。此外，低温也可降低生物降解的速度5。

（2）湿度。游离态的水分子会直接的促使生物检材中的DNA分子降解，而极度干燥的环境也可能会造成DNA分子的结构发生变化。

（3）其它因素，主要包括核酸酶、土壤微生物、以及强酸强碱、紫外线等因素等等。

现阶段，针对DNA降解检材，DNA的检测方法主要有[5]：

（1）对大片段的DNA进行回收；

（2）对DNA进行修复；

（3）缩短扩增子；

（4）线粒体DNA的测序；

（5）全基因组扩增；

（6）电泳前先进行相应的纯化工作；

（7）其他方法。

3 DNA抑制剂含量超高的检材

对于某些生物物证检材样本的分析，往往会受从检材中提取到的DNA的质量和数量所影响。而生物物证检材通常都会包含一些抑制剂，而这些抑制剂将会影响DNA的纯化和PCR扩增。常见的DNA抑制剂有：存在于毛发和组织中的黑色素；存在于骨骼和组织中的胶原和磷酸钙；存在于土壤中的腐殖酸；存在于新鲜血液中的血红素以及存在于衣物和各种纺织品中的单宁和染料等。

近年来，人们为了去除这些PCR抑制剂，尝试了各种各样的方法，比如稀释DNA样本，加入牛血清蛋白，以及在PCR中加入额外的Taq酶等等。

现阶段，一种新型的SCODA6（同步旋转电场技术）正逐步进入人们的视野中。SCODA技术可以在不同类型的样本中，提取DNA，去除抑制剂，同时对DNA进行浓缩。SCODA技术利用交互的电磁场，使带有电荷的DNA集中在中央，而其它的不带电荷的物质则远离磁场，从而达到将DNA与抑制剂分离的目的。研究表明，SCODA可以有效的移除用一般的二氧化硅膜无法清除的抑制剂。除此之外，SCODA技术中存在的浓缩的步骤，可以增大提取的体积，促进DNA的修复。SCODA技术在许多富有挑战性的样品，如骨头和稀释过的可疑斑点等含抑制剂较高的疑难检材中均具有很好的效果。

研究表明，SCODA电泳提取纯化技术相对于传统的纯化试剂盒的优势明显，主要包括：

（1）它可以提高低拷贝DNA检材的提取量和纯度，获得更高PCR扩增的成功率；

（2）它可以高效的去除检材中的抑制剂和污染物。有效的去除血液、组织、毛发、骨头、纺织品、土壤等各种检材中的抑制剂和污染物。与传统技术相比较发现，SCODA技术对污染物的去除更彻底，可直接用于后续的扩增、克隆和分析；

（3）它可以有效的保持DNA片段的完整性，不会因机械作用而造成DNA片段的损伤或者毁坏。

4 混合DNA检材

混合DNA检材，通常来讲，是由两名或两名以上个体的血液、精液、分泌物、排泄物、脱落上皮细胞等同种或不同种类型的DNA附着在不同的犯罪现场载体上形成的。在实际的案件中，以强奸案中精液和阴道分泌液组成的混合检材最为常见。近年来，由于现场勘察技术的提高，仪器检测灵敏度的增强以及实验室操作水平的提升等种种因素，使得及其微量的DNA也可能被检测到，那么随之而来的混合DNA检材所占的比例也越来越高。如入室盗窃，抢劫，打架斗殴等案件中，混合检材出现的可能性越来越大。此外，混合样本也可能来源于污染，包括检材采集人员或实验室检验人员的污染，以及实验仪器及耗材品的污染等等。

现在，对混合DNA检材的检验分析主要着重于[3]：

（1）常规实验完成后，利用相关的软件进行分解；

（2）在实验阶段，对组分进行相应的分离；

（3）用特定的试剂盒来检验目标组分。

目前，国内大部分实验室对于混合DNA图谱主要进行的是人工手动拆分。主要拆分方法为：根据每个位点下存在的峰的个数、峰高等参数进行拆分。但是人工拆分的主观因素较大；考虑的因素比较单一，只是单个位点，逐个的去拆分，没有整体考虑整个图谱；拆分时没有量化的标准，导致不确定性较大。而国际上则较多的借助软件进行拆分，软件主要是利用统计学的方法去解释混合图谱的数据。软件拆分的优势在于：有可量化的标准；可重复性好；减少主观性，结果更加客观公正。

综上所述，我们依次对微量DNA检材，DNA降解检材，DNA抑制剂含量超高的检材以及混合DNA检材的检验方法进行了探究。在今后的疑难生物检材提取时，要结合实际案例，寻求最有效的方法，尽可能的完成DNA的检验。

[1]张瑶.浅谈爆照案件的特点及侦防对策[J].中国刑警学院学报,2008(02):20-21.

[2]党华伟,毛炯,王惠,黄江平,白小刚.疑难生物检材法医DNA检验的现状与进展[J].法医学杂志,2012,28(01):52-54.

[3]董迎春,李诗柳,言梦非,刘宗伟,朱怡.1025例涉案手机和电脑接头类检材的DNA检验分析[J].刑事技术,2015,40(04):332-333.

[4]侯一平．法医学进展与实践(第七卷)[M].成都：四川大学出版社,2010:1-6.

[5]Sarah Schmedes & Pamela Marshall& Jonathan L.King &Bruce Budowle.Effective removal of co-purified inhibitors from extractedDNA samples using synchronous coefficient of drag alteration[J].Int J Legal Med,2013,127:749-755.

刘鑫（1988-），女，山东省淄博市人。助教。山东警察学院研究生，法医学。