制备型高效液相法分离苦瓜抑菌活性成分

孟晓，马力

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

制备型高效液相法分离苦瓜抑菌活性成分

孟晓，马力*

（西华大学生物工程学院，四川 成都 610039）

选择200目～300目硅胶为柱填料，以抑菌效果为评价指标，利用制备型高效液相法（Pre－HPLC）对苦瓜提取液浸膏中的抑菌活性成分进行分离。结果表明：当流动相配比石油醚（60℃～90℃）∶乙酸乙酯为7∶3，进样量0.5 mL，流速5 mL/min时，检测器在280 nm波长处所检测到的物质抑菌效果最好，其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显，抑菌圈直径为12 mm，对照组没有抑菌效果。

制备型高效液相法；苦瓜；抑菌

苦瓜（Momordica charantia L.）又称凉瓜，是葫芦科苦瓜属植物。据研究表明[1-3]，苦瓜作为一种药食同源的瓜类蔬菜，具有增强免疫能力、抑菌、降血糖、抗癌、抗肿瘤、抗氧化、治疗糖尿病、治疗艾滋病等药理作用。

近十几年来，随着人们对分离与纯化技术的不断探索，色谱分离技术得到了迅速发展，制备高效液相色谱法已成为当代高效分离技术的研究前沿，用于制备高质量的生物活性物质[4-5]。本文以抑菌效果为评价指标，采用制备型高效液相法（Pre－HPLC）对苦瓜提取液中的抑菌活性成分进行分离，旨在获得具有较好抑菌效果的一类物质，为下一阶段对该类物质相关性质的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

苦瓜粉：市场自购。

1.1.2 试剂

石油醚（60℃～90℃）、乙酸乙酯、无水乙醇、营养琼脂：分析纯，成都科龙化工试剂厂。

1.1.3 菌种

大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由西华大学实验中心提供。

1.1.4 仪器

AKTA Purifier10制备型高效液相色谱仪：GE公司；SHB-3循环水多用真空泵：郑州杜甫仪器厂；RE-52B旋转蒸发仪：上海亚荣生氏仪器厂；JY92-2D超声波细胞粉碎仪：宁波新芝科器研究所；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

以70%乙醇为溶剂，采用超声波辅助提取苦瓜粉，用二氯甲烷萃取提取液，水浴挥干溶剂，得苦瓜提取液浸膏；准确称取苦瓜提取液浸膏0.50 g，无水乙醇溶解，配制成浓度为50 mg/mL的溶液，过0.45 μm的微孔滤膜，供分析和制备用。

1.2.2 色谱条件

自填硅胶柱（12 mm×300 mm，200目～300目）；流动相：石油醚-乙酸乙酯；流速5mL/min；检测波长280nm；进样量 50 μL。

1.2.3 洗脱液收集

采用制备型高效液相系统对按照1.2.1处理好的样品在1.2.2的色谱条件下进行分离，按照出峰顺序收集洗脱液，浓缩，挥干流动相，干燥备用。

1.2.4 抑菌效果评价

用无菌镊子将灭菌后的滤纸片（6 mm）放入1.2.3的样品液中，浸泡0.5 h后取出，挥发掉乙醇；吸取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液于无菌平皿中，均匀地涂布于凝固的培养基表面；将含样品的纸片贴于平板上，每种设3个重复，然后以无菌水作为对照，放入培养箱中，37℃下培养24 h。取出测定抑菌圈直径，取其平均值。

2 结果与讨论

2.1 样品粗分离与抑菌效果比较

在流动相:石油醚-乙酸乙酯（9∶1）；流速 5 mL/min；检测波长280 nm；进样量50 μL的色谱条件下对1.2.1的样品进行分离，得到色谱图如图1所示。

如图1所示，利用上述色谱条件对1.2.1的样品液进行分离后，在280 nm波长处共检测到4个峰，其中1号峰和2号峰都是在流动相配比为石油醚：乙酸乙酯（9∶1）时洗脱下来的，说明这两种物质都属于弱极性物质；而3号峰和4号峰则是用无水乙醇洗脱下来的，因此这两类物质可以归为极性物质。最后，按照1.2.3的处理方法对各洗脱液进行处理，分别取等量各干燥样品，等体积无水乙醇溶解，进行抑菌试验。结果表明：在2号峰处收集的洗脱液抑菌效果最好，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较为明显的抑制效果，其抑菌圈直径分别为13 mm和12 mm。结果见图2。

2.2 样品细分离与抑菌效果比较

改变色谱条件，即流动相∶石油醚-乙酸乙酯（7∶3）；流速 5 mL/min；检测波长 280 nm；进样量 50 μL。在此条件下对2.1中的2号峰洗脱液进行再分离，得到色谱图如图3所示。

可知，利用上述色谱条件对2号峰的洗脱液进行分离后，在280 nm波长处共检测到三个峰，其中2-1号峰和2-2号峰都是在流动相配比为石油醚：乙酸乙酯（7∶3）时洗脱下来的，说明这两种物质都属于弱极性物质；而2-3号峰则是用无水乙醇洗脱下来的，因此这类物质可以归为极性物质。最后，按照1.2.3的处理方法对各洗脱液进行处理，分别取等量各干燥样品，等体积无水乙醇溶解，进行抑菌试验。结果见图4。

图4结果表明：在2-2号峰处收集的洗脱液抑菌效果最好，其对金黄色葡萄球菌有较为明显的抑制效果，抑菌圈直径为12 mm，但其对大肠杆菌没有明显的抑制作用。

3 结论

通过试验表明，在不同色谱条件下对苦瓜提取液浸膏进行粗分离和进一步的细分离，最后在色谱条件为流动相∶石油醚-乙酸乙酯（7∶3）；流速 5 mL/min；检测波长280 nm；进样量50 μL时，从中分离得到2-2号峰收集到的洗脱液抑菌效果最好，其对金黄色葡萄球菌有较为明显的抑制效果，抑菌圈直径为12 mm，但其对大肠杆菌却没有明显的抑制效果。分析其原因可能有两点：第一，在该峰处收集到的抑菌活性物质的浓度还没有达到抑制大肠杆菌生长的范围，通过进一步增大其浓度进行抑菌试验，仍没有明显效果；第二，该活性物质可能是与其它类物质协同作用起到抑制的效果，经过进一步的细分离之后，其它类物质被分离开，从而导致其失去抑制大肠杆菌生长的作用。

总之，运用制备型高效液相法对苦瓜提取液浸膏进行分离，分离高效快速，并且通过重复试验证明该法具有很好的重现性，能够得到抑菌效果较好的一类物质，以便于下一阶段对该类物质的性质做进一步的分析研究。

[1]万新建,陈学军,缨南生.我国苦瓜的研究现状及展望[J].江南农业学报,2002(6):46-50

[2]袁杰,杜琪珍.苦瓜中活性成分的初步研究[J].食品研究开发,2004(1):108-109

[3]向亚林,凌冰,张茂新.苦瓜化学成分和生物活性的研究进展[J].天然产物研究与开发,2005,17(2):242-246

[4]高明哲,袁晓艳,肖红斌.制备型高效液相色谱法从积雪草提取物中分离纯化积雪草甙和羟基积雪草甙对照品[J].色谱,2008,26(3):362-365

[5]王永禄,王丽瑶.制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用[J].中医药通报,2006,5(3):60-63

Research on the Antibacterial Activity Components of Momordica Charantia L by Preparative High Performance Liquid Chromatography

MENG Xiao，MA Li*
（School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

The antibacterial activity components of Momordica charantia L.were separated by the preparative high performance liquid chromatography （Pre－HPLC）.The result shows:the best antibacterial activity components were separated under the conditions of the petroleum ether（60 ℃－90 ℃）:ethyl acetate is 7∶3,0.5 mL of injection volume,5 mL/min of velocity,the detection wavelength is 280 nm.The Staphylococcus aureus was inhibited well and the Inhibition zone diameter is 12 mm.

Pre-HPLC;momordica charantia L.;antibacterial

孟晓（1983—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

*通讯作者

2009-08-13