乌贼墨提取物对环磷酰胺致肝损伤小鼠肝功能的保护作用研究

黄银燕 ，杨翠玲 ，李伟东 ，肖韵 ，王光 ，李鹏 ，陈远平 ，钟杰平 ,*

（1.广东海洋大学实验教学部，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学理学院，广东 湛江 524088；3.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

乌贼墨提取物对环磷酰胺致肝损伤小鼠肝功能的保护作用研究

黄银燕1，杨翠玲2，李伟东2，肖韵2，王光3，李鹏3，陈远平2，钟杰平2,*

（1.广东海洋大学实验教学部，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学理学院，广东 湛江 524088；3.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

探讨乌贼墨提取物对环磷酰胺所致肝损伤小鼠肝功能的保护作用，以及在不同浓度条件下的作用效果。40只BALB/C小鼠，随机分成4组。观察各组小鼠的肝重系数及肝组织中SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）、GSH-Px（谷胱甘肽过氧化物酶）、MDA（丙二醛）和血液中SOD、MDA的变化。环磷酰胺能显著的改变正常小鼠肝重系数（P＜0.05），不同程度的降低正常小鼠肝组织中 SOD,CAT,GSH-Px活力（P＜0.01或 P＜0.05）及 MDA 含量（P＜0.01），较低浓度的乌贼墨提取物均能不同程度的改变由环磷酰胺所致的正常小鼠肝组织中上述各项指标的变化（P＜0.01或P＜0.05），而较高浓度的乌贼墨提取物对上述各项指标的改善作用有所减弱，有的甚至没有作用（P＞0.05），同样的结果也在血液学指标中有所体现。

乌贼墨提取物；环磷酰胺；肝功能；抗氧化

乌贼属于软体动物门，头足纲，乌贼目，乌贼科，乌贼属的一种海洋动物。乌贼墨是储存于乌贼墨囊内腔中，当乌贼遇到天敌时喷出的一种防身物质，可影响或者麻痹入侵者的视觉和嗅觉。乌贼墨可以通过影响纤溶系统降低纤溶酶活性，减少纤维蛋白的溶解促进凝血[1]。近年来发现乌贼墨及其提取物具有抗肿瘤[2-4]，抗氧化[5-6]，降血脂[7]，增强免疫[8]等重要功能。在日本，人们将粉末状或液状乌贼墨熬好后渗入至食品中，目前，日本已经有含有乌贼墨的面条、面包、小麦粉制的甜点心和鱼糜制品面世，添加量在0.2%～1.5%之间。还有用乌贼墨和扇贝汁做成的乌贼墨汤面，由于其公认的含有抗癌物质，也因此自然地形成了一种简易的健康食品，深受广大消费者的欢迎。

我们采用腹腔注射环磷酰胺造肝损伤模型，通过口服灌胃乌贼墨提取物来观察其是否对肝损伤小鼠的肝功能具有保护作用，进而开发这种海洋废弃物的食药同源性，对于充分利用海洋资源，扩大药源有参考意义。

1 材料和方法

1.1 动物

健康的 BLAB/C 小鼠（SPF）,体重（20±2）g：购自广东医学院实验动物中心（合格证号：2007A035）。

1.2 试剂、仪器及药物

环磷酰胺：江苏恒瑞股份有限公司；MDA、SOD、CAT、GSH-Px测试试剂盒：南京建成生物工程研究所；722s可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；乌贼：湛江市东丰市场；所有试剂均为分析纯。

1.3 乌贼墨提取物的制备

取新鲜乌贼墨，加3倍体积冰冷的PBS（pH6.86）稀释，研钵内研磨，超声波破碎，4℃，5000 r/min,离心20 min，上清液冷冻干燥成粉末，储存于-80℃。样品用生理盐水稀释到相应浓度进行灌胃。

1.4 分组、给药及处理方法

小鼠随机分为4组，雌雄各半，试验期间均正常饮水,普通饮食。对照组（以每千克体重计）:灌胃生理盐水（2.4 g）和腹腔注射生理盐水（200 mg）；模型组（以每千克体重计）：灌胃生理盐水（2.4 g）和腹腔注射环磷酰胺（200 mg）；低剂量组（以每千克体重计）：灌胃低浓度乌贼墨提取物（1.2g）和腹腔注射环磷酰胺（200mg）；高剂量组（以每千克体重计）：灌胃高浓度乌贼墨提取物（2.4 g）和腹腔注射环磷酰胺（200 mg），小鼠适应性饲养1周后，按上述分组情况给与灌胃生理盐水和指定浓度的乌贼墨提取物10 d，然后连续腹腔注射生理盐水和给定浓度的环磷酰胺3 d，在注射期间正常灌胃，此后继续灌胃10 d，灌胃结束后次日处死小鼠，检测各项指标。环磷酰胺用生理盐水配置。

1.5 指标的测定

肝重系数=肝重/体重（mg/g）；MDA、SOD、CAT 和GSH-Px活力测定，均严格按照试剂盒说明进行操作。

1.6 统计学方法

数据以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析。组间差异采用t-检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝重系数变化的比较

肝重系数的变化见图1。

与对照组比较，环磷酰胺组能够显著地增大肝重系数（P＜0.05），与模型组比较，不同剂量的乌贼墨提取物又能不同程度的改善环磷酰胺的这种作用，其中低剂量组的作用极其显著（P＜0.01）,高剂量组的作用反而有所减弱（P＜0.05）。

2.2 肝组织和血液中SOD活力的测定

肝组织和血液中SOD的变化如图2和图3。

与对照组比较，环磷酰胺组能够显著的降低肝组织中SOD活力（P＜0.05）和极其显著地降低血液中SOD活力（P＜0.01）,与环磷酰胺组比较，不同浓度的乌贼墨提取物均能显著地改善由环磷酰胺所致的肝组织中SOD活力降低的变化（P＜0.05），不同浓度间不存在显著差异，而对于血液中SOD的影响低剂量组极其显著（P＜0.01），高剂量组不显著。

2.3 肝组织和血液中MDA含量的测定

肝组织和血液中MDA含量的变化见图4和图5。

与对照组比较，模型组能极其显著地提高肝组织和血液中MDA含量（P＜0.01），同时，与模型组比较，较低浓度的乌贼墨提取物能够显著地改善环磷酰胺所致的这种MDA含量升高的作用（P＜0.05），而较高浓度的乌贼墨提取物改善作用不显著 (P＞0.05)，而在血液中，低、高剂量组均能极其显著地拮抗环磷酰胺的毒副作用（P＜0.01）。

2.4 肝组织中CAT活力的测定

肝组织中CAT活力的变化如图6。

与对照组比较，环磷酰胺组能显著地降低肝组织中CAT活力（P＜0.05），与模型组比较，较低浓度的乌贼墨提取物能显著地改善这一变化(P＜0.05)，而高剂量组却没有明显的改善作用(P＞0.05)。

2.5 肝组织中GSH-Px活力的测定

肝组织中GSH-Px的变化见图7。

与对照组比较，环磷酰胺组能显著的降低肝组织中GSH-Px的活力（P＜0.05），与模型组比较，低浓度的乌贼墨提取物能显著的改变由环磷酰胺所致的小鼠肝组织中GSH-Px活力降低的作用（P＜0.05），较高剂量组的改善作用却没有显著变化（P＞0.05）。

3 结论与讨论

SOD是一种带阴性电荷的金属蛋白酶，主要功能是催化超氧阴离子的歧化反应，由于超氧阴离子常是活性氧生成过程中的初始产物，因此SOD也被看作为活性氧防御的第一线。CAT也是金属酶，主要功能为催化过氧化氢分解为水和氧。GSH-Px的主要功能是催化还原型谷胱甘肽对过氧化物的还原反应，进而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，他们的作用都是使机体免受自由基的攻击。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的代谢产物,其含量的变化间接反映了组织中氧自由基含量变化,因此可通过测定MDA含量来评价组织中氧自由基的水平和脂质过氧化的强弱。

试验表明环磷酰胺均能显著的降低正常小鼠肝组织中SOD,CAT,GSH-Px活力，和升高正常小鼠肝组织和血液中MDA含量，说明这种应激性肝损伤打破了自由基代谢的动态平衡,启动自由基连锁反应,使肝脏损伤程度加重。通过不同浓度乌贼墨提取物的灌胃，环磷酰胺模型小鼠肝组织内的SOD,CAT,GSH-Px的活力均显著提高，MDA含量显著下降，均说明乌贼墨提取物对环磷酰胺所致的肝损伤小鼠的肝功能具有一定的保护作用，同时，试验表明，高浓度的乌贼墨提取物的保护作用比低浓度乌贼墨提取物的作用要弱，有的甚至不起作用，至于高浓度的乌贼墨提取物是否具有一定的细胞毒性，还有待于进一步研究。

另外，试验结果表明，环磷酰胺能显著地增大正常小鼠的肝重系数，可能是产生的过多的自由基导致氧化应激使肝脏代偿性增大，或是由于肝细胞损伤导致的肝内纤维生成与降解失衡，使肝内胶原纤维含量增多而导致的肝重系数增大。经过适当浓度的乌贼墨提取物的灌胃能显著地改变由环磷酰胺所致的正常小鼠肝重系数的变化。

[1]谢光临,吕昌龙,洪明标,等.乌贼墨促凝血作用机制的实验研究[J].中国医科大学学报,1994,23(6):530

[2]Takaya Y,Uchisawa H,Matsue H,et al.An investigation of the antitumor peptidoglycan fraction from squid ink[J].Biol Pharm Bull,1994,17(6):846

[3]苏伟明,马润娣,于立坚,等.中国枪乌贼墨汁提取物的抗肿瘤作用[J].中国海洋药物杂志,2005,24(2):47

[4]刘成玉,滕青,周绪祥,等.乌贼墨对红细胞免疫粘附肿瘤细胞能力的影响[J].中国海洋药物杂志,1996(3):15

[5]陈士国,薛长湖,薛勇,等.鱿鱼墨黑色素的自由基清除活性研究[J].中国海洋药物,2007,26(1):24

[6]张永军,徐秀云,王保全,等.复方乌贼墨胶囊对小鼠SOD活性的影响[J].中国新医药,2003,2(1):32

[7]雷敏,王静凤,逄龙,等.乌贼墨对高脂血症大鼠血脂代谢和抗氧化能力的影响[J].中国海洋药物,2007,26(3):30

[8]赫甡,孟胜男,谢光麟.乌贼墨诱导小鼠巨噬细胞产生白细胞介素-1的研究[J].中国海洋药物,2003,22(5):17

Protective Effect of Sepia Ink Extract on Liver Function of Liver Injury Mice Induced by Cyclophosphamine

HUANG Yin-yan1，YANG Cui-ling2,LI Wei-dong2,XIAO Yun2,WANG Guang3,LI Peng3,CHEN Yuan-ping2,ZHONG Jie-ping2,*
（1.Modern Biochemistry Center,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088，Guangdong,China;2.College of Science,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088，Guangdong,China;3.College of Food Science&Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088，Guangdong,China）

To explore the protective effects of sepia ink extract on liver function of liver injury mice induced by cyclophosphamine,and the different result at the different concentration of sepia ink extract.A total of 40 mice were divided into 4 groups,control group,model group,low dose-and high dose-group.Model group was established with abdominally injection of cyclophosphamine.The activity of SOD,CAT,GSH-Px and the contents of MDA in liver and in blood and the index of liver was were observed.Compared with control group,cyclophosphamine changed significantly the index of liver（P＜0.05）,and incoordinately changed the activity of SOD,CAT,GSH-Px and the contents of MDA in liver and in blood（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with model group,the low dose-group,sepia ink also incoordinately changed the parameters induced by cyclophosphamine significantly（P＜0.05 or P＜0.01）.Whereas,the protective of the high concentration of sepia ink extract was reduce than the low dose-group on the changes,sometimes,it had no obvious effect（P>0.05）.The suitable concention of Sepia ink extract can play a definite protective role on liver function of liver injury mice.

sepia ink extract;cyclophosphamine;liver function;anti-oxidative

广东省科技计划项目（2008B021100014）；广东海洋大学人才引进项目；广东海洋大学学生研究创新性实验基金

黄银燕（1965—），女（汉），实验员，研究方向：海洋活性物质的分离提取。

*通讯作者：钟杰平，男，教授，研究方向：海洋应用化学。

2009-07-07