浅析遗传多样性的研究方法

陈珊珊，周明芹 (长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

浅析遗传多样性的研究方法

陈珊珊，周明芹
(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

综述了检测遗传多样性的形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和分子标记4种遗传标记的发生与发展过程，并比较了各自的优缺点及其应用。

遗传多样性、形态学标记、细胞学标记、生物化学标记、DNA分子标记

遗传多样性(genetic diversity)是生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础，任何物种都有其独特的基因库或遗传组织形式[1]。广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和，但通常所说的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内不同种群之间或一个种群内不同个体的遗传变异[2]。遗传多样性的表现形式是多层次的，可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及DNA序列等不同方面来体现，其中DNA多样性是遗传多样性的本质[3]。通常，遗传多样性最直接的表现形式就是遗传变异水平的高低。然而，对任何一个物种来说，个体的生命是短暂的、有限的，而由个体构成的种群或种群系统(宗、亚种、种)在自然界中具有其特定的分布格局，在时间上连续不断，是进化的基本单位。因此，遗传多样性不仅包括变异水平的高低，而且包括变异的分布格局，即种群的遗传结构。种群遗传结构上的差异是遗传多样性的重要体现，一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力既取决于种内遗传变异的大小，也有赖于种群的遗传结构[4]。

遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义。物种或居群的遗传多样性程度是长期进化的产物，是其生存(适应)和发展(进化)的前提。一个居群(或物种)遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境，因此，对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史(起源的时间、方式等)，也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料，尤其有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨。遗传多样性的研究不仅与资源的收集、保存和更新密切相关，而且是种质资源创新和品种改良的基础。准确评价在DNA分子水平上的遗传多样性，不仅可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势的预测提供预见性指导，而且还有助于了解品种间的系谱关系，进行品种鉴定和品种分类以及分析物种的起源与进化[1～4]。

对遗传多样性的系统研究始于十九世纪，达尔文在《物种起源》中用大量资料和证据揭示出生物中普遍存在变异现象，并发现了大部分变异有遗传现象，他把这种可遗传的变异称为多样性。随着孟德尔遗传定律的重新发现，摩尔根染色体遗传学及后来发展的细胞遗传学的诞生为群体遗传理论的发现奠定了基础并提供了科学的实验证据，充分证实了在自然界中确实存在大量的遗传变异。

随着生物学理论和技术的不断进步，以及实验条件和方法的不断改进，检测遗传多样性的方法日益成熟和多样化，可从不同的角度和层次来揭示物种的变异。遗传标记(genetic markers)的发展经历了形态学标记(morphological markers)、细胞学标记(cytological markers)、生物化学标记(biochemical markers)和分子标记(molecular markers)4个主要阶段。

1 形态学标记

形态学标记是与目标性状紧密连锁、表型上可识别的等位基因突变体，即植物的外部特征特性。典型的形态学标记用肉眼即可识别和观察；广义的形态学标记还包括借助简单测试即可识别的性状，如生理特性、生殖特性、抗病虫性等[5]。从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法。通常所利用的表型性状有2类，一类是符合孟德尔遗传规律的单基因性状，如质量性状、稀有突变等，另一类是由多基因决定的数量性状[6]。由于自然界中单基因性状较少，作为遗传标记，主要是用于一些农作物、林木、园艺作物及其野生近缘种的遗传多样性研究，而且多用于研究交配系统、基因流和选择等进化因素。而数量性状的变异则大量存在，对其进行研究同样能分析居群或个体的遗传变异，并且结合数量遗传学的方法来研究数量性状的遗传变异，通过特定的杂交试验和后代测定能分析性状在亲本与子代间的传递规律，并将影响变异的遗传因素同环境因素区分开，从而确定遗传因素在性状变异中的相对重要性；同时能分析遗传和环境的交互作用，甚至可以估算控制数量性状的多基因的位点数目[2，3]。

形态学标记已被广泛应用于遗传图谱的构建[7]、品种演化与分布历史推测[8]、种质资源遗传多样性的分析[9，10]、种质资源的分类与鉴定[11，12]、杂交亲本的选配和核心种质的构建[13]等研究中。

虽然用形态学标记研究遗传多样性具有简便、易行、快速等特点，但是，由于表型性状是基因型与环境共同作用的结果，往往因环境因素的影响而发生变化，有时表型性状的变异并不能真实反映遗传变异；同时，形态标记数量有限，观测标准容易受到观测者的主观判断影响。因此，要更加准确、全面地了解物种的遗传多样性，仅仅依赖形态标记是远远不够的，还必须结合其他的标记技术，进行更深层次的研究[14]。

2 细胞学标记

细胞学标记主要是染色体的核型和带型分析。染色体是遗传物质的载体，是基因的携带者。与形态学变异不同，染色体的变异必然会导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要来源。研究表明，在任何生物的天然居群中，都存在或大或小的染色体变异。染色体的变异主要表现为染色体组型特征的变异，包括染色体数目的变异(整倍性或非整倍性)和染色体结构的变异(缺失、易位、倒位、重复等)，染色体的形态(着丝点位置)、缢痕和随体等核型特征也是多样性的来源。染色体分带(chromosome banding) 指借助于一套特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的带纹，常见染色体带型有C 带、G 带、R 带、Q 带等[15]。在植物中，染色体的多倍性现象广泛存在，Lewin研究发现约7%的双子叶植物有多倍现象，共涉及114科660属2 800种[16]。

植物染色体的数目、形态等是最稳定的细胞学特征之一，染色体的核型、带型等是表明该种系统演化位置以及和近缘种亲缘关系的重要依据，是探讨植物亲缘关系和进化趋势的一个重要途径[17]。Tuna等[18]研究了无芒雀草(Bromusinermis)染色体的核型和带型，推测四倍体无芒雀草可能是异源四倍体，八倍体无芒雀草不是由四倍体的染色体直接加倍形成的。Liu等[19]对山龙眼科Leucadendron属27个物种的核型进行研究，发现它们的染色体都具有对称性，从细胞学的角度证明了该属的原始性。汪卫星等[20]比较番木瓜(Caricapapaya)的四倍体与二倍体植株的核型特征，发现二者没有明显的区别，由此认为其四倍体是由二倍体直接加倍形成的同源四倍体。

细胞学标记直观、稳定，克服了形态标记易受环境条件影响的缺点。随着染色体技术的发展，如细胞原位杂交技术的应用，在染色体水平上将揭示出更加丰富的遗传多样性。但是有些物种忍受染色体结构和数目变异的能力较差而难以获得相应的标记材料，某些物种虽有标记材料，但常常伴随着标记对生物有害的表型效应，使观测和鉴定比较困难，而且大多数染色体的细胞学标记数目有限，导致该技术在较低分类阶元的应用受到限制[21，22]。

3 生物化学标记

生物化学标记是指利用植物代谢过程中具有特殊意义的生化成分或产物进行品种鉴定和遗传多样性研究的技术。许多生物大分子或生物化合物都具有作为遗传标记的潜力。一些次生代谢物如香精油、类黄酮、糖苷类、类萜等都可以作为遗传标记来评价遗传多样性[23]，但由于分离和检测这些分子的技术和手段比较复杂，很难适应大群体的常规检测，因而在实际研究中，用次生代谢物作为遗传标记的很少[24]。与此相反，许多蛋白质(包括非酶蛋白和酶蛋白)分子数量丰富、分析简单快速，能更好地反映遗传多样性，是比较理想的遗传标记。在非酶蛋白中，用的比较多的是种子贮藏蛋白[25～28]；在酶蛋白中，用的比较多的是同工酶(isoenzyme)[29，30]。同工酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质不同的一类酶，其结构的差异来自基因类型的差异，其电泳酶谱的多态性可能是由不同的基因引起的，也可能是由同一基因座位上的不同等位基因引起的，后者特称为等位酶(allozymes)。

同工酶标记(isoenzyme marker)是20世纪60年代兴起的一门标记技术，广泛应用于种群遗传结构与交配系统的研究，种群内与种群间等位基因频率的估测以及品种鉴定[31～34]等方面。

同工酶在生物界普遍存在，并以共显性方式表达，几乎不受环境因素的影响，表现出相对稳定性。但是同工酶是基因表达的产物，具有组织特异性，易受发育阶段的影响[22]；只能检测编码蛋白的基因位点，不能检测非结构基因位点；加上能够利用的具有多态性的同工酶种类有限，并且每种酶检测的位点数目较少，多态性不高，因此在多数情况下，同工酶标记没有DNA标记敏感，其多态性也没有DNA标记高[35，36]。

4 DNA分子标记

形态学标记、细胞学标记和同工酶标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限、多态性较差。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列差异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映，能更准确地揭示种、变种、品种、品系乃至无性系间的差异。与前3种标记相比，DNA标记具有以下优越性：(1)较高的可靠性，直接以DNA的形式表现，不受环境因素、取样部位和发育阶段的影响，不存在基因表达与否的问题；(2)数量多，遍及整个基因组；(3)多态性高，自然存在着许多变异；(4)表现为“中性”，不影响目的基因的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型[37，38]。由于分子标记的巨大优越性，近年来在生物科学领域中的应用相当广泛。根据所依赖的技术手段的不同，DNA分子标记可分为3大类：第一类是以杂交技术为基础的分子标记，如限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，简称RFLP)标记、数目可变串联重复多态性(variable number of tandem repeats，简称VNTR)标记；第二类是基于PCR技术为基础的分子标记，如随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA，简称RAPD)标记、任意PCR(arbitrary primed PCR，简称AP-PCR)标记、DNA指纹(DNA amplified fingerprints，简称DAF)标记、序列特征化扩增区域(sequence-characterized amplified regions，简称SCAR)标记、扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism，简称AFLP) 标记、简单重复序列 (simple sequence repeats，简称SSR)标记、内部简单重复序列(inter-simple sequence repeat，简称ISSR)标记等；第三类是基于测序和DNA芯片技术为基础的分子标记，如表达序列标签(expressed sequence tags，简称EST)标记和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，简称SNP)标记等[39]。随着分子生物学研究的重心逐渐从结构基因组学向功能基因组学转变，高等植物的分子标记也开始由过去基于基因组DNA 随机开发的、位置不确定的DNA标记向代表转录谱和其他编码序列的分子标记以及具有相应功能的功能标记发展。Andersen 和 Lübberstedt根据分子标记的发展过程定义了相应的3种类型的分子标记，即随机DNA标记(random DNA marker，简称RDM)、基因靶向标记(gene targeted marker，简称GTM)和功能标记(functional marker，简称FM)。随机DNA标记指的是来自于基因组中随机的多态性位点的标记；基因靶向标记是来自于基因转录区多态性位点的标记；功能标记也是来自于基因转录区的多态性位点，但它的多态性能造成所在基因编码的表型性状的变异[40]。

自20世纪90年代以来，DNA分子标记一直是生命科学领域活跃发展的一种生物技术，不仅应用广泛，而且新的分子标记种类不断涌现。各种类型的标记层次特点不同，都有各自的优势和局限性。理想的DNA分子标记应具备以下特点：(1)遗传多样性高；(2)共显性遗传；(3)在基因组中大量存在且分布均匀；(4)表现为“中性”，对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；(5)稳定性、重现性高；(6)信息量大，分析效率高；(7)检测手段简单快捷，易于实现自动化；(8)开发成本和使用成本低[41]。但是迄今为止，没有一种标记能完全满足上述特性。因此，在具体的研究中，应该根据所分析材料的遗传背景、研究状况、实验目的以及实验条件来选用最合适的标记技术，或同时采用几种方法进行，以便多层次、多角度、更全面、更准确地揭示物种或种群的遗传多样性水平。随着分子生物学的发展和生物技术的不断完善，相信越来越多的分子标记技术将被开发，为人类揭开生物之谜提供更有效的工具。

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2010-07-01

陈珊珊(1988-)，女，湖北天门人，研究方向为园林植物应用.

周明芹，E-mail: zhoumingqin@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.019

Q3-3

A

1673-1409(2010)03-S054-04