针刺足三里、关元穴对脓毒症大鼠胸腺细胞凋亡的影响

郭小文 朱美飞 徐勇刚 雷 澍

浙江省中医院（杭州 310006）

脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术和感染后常见并发症,其本质为不同感染性因素所致失控性炎性反应。细菌、真菌、病毒及其毒性产物等均可诱发本病。临床流行病学资料显示,脓毒症是危重症患者的主要死亡原因之一,现已成为进一步提高危重症救治成功率的最大障碍。脓毒症患者常伴有免疫抑制，是脓毒症预后差的主要原因，同时脓毒症免疫抑制与淋巴细胞凋亡加速关系密切[1]。减轻脓毒症的淋巴细胞凋亡不但能提高免疫功能，而且能改善预后。已有多项研究证实，针刺足三里、关元穴能提高机体免疫功能，但其机制尚未完全阐明。本研究以盲肠结扎穿孔（CLP）致腹腔感染脓毒症大鼠为模型，研究电针足三里、关元穴对胸腺细胞凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：SD健康大白鼠(由浙江中医药大学实验动物中心提供），体质量200～250g，雌雄各半。（2）主要设备与仪器：G6805－A型电针治疗仪由上海医疗仪器厂生产，AnnexinⅤ－PI双染试剂盒购自罗氏公司，血管活性肠肽 (VIP）放免试剂盒由北京海科锐生物制品有限公司提供，Epics－profile型流式细胞仪由美国Coulter公司生产。

1.2 方法 （1）分组及造模：应用分段随机分组法将大鼠分为3组(每组12只）：正常对照组、模型组、针刺组。大鼠以盐酸氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉后，作1～2cm长的腹正中切口。游离出盲肠并用30号丝线结扎，以22G针头于盲肠穿刺2处，并挤出小量肠内容物以保持穿刺孔开放。还纳肠管，以丝线缝合关腹。术毕皮下注射生理盐水2mL。所有实验大鼠均在安静环境下统一喂养。针刺组每日针刺足三里穴，进针5～7mm，关元穴进针3～5mm，通电留针30min，采用连续波，频率3次/s，强度以针柄颤动，但能使动物不挣扎嘶叫，保持安静为度。定位取穴参照《实验针灸学》[2]。针刺组于术后复苏成功后分别于即刻、12h和24h行电针治疗。正常对照组与脓毒症模型组大鼠每日相同时刻以同样方法固定30min，但不行电针刺激。（2）标本采集及测定：所有大鼠于术后36h处死，收集标本进行凋亡检测。光学显微镜和透射电镜下观察胸腺形态学改变。Annexin－PI双染色法标记，网搓法分离胸腺细胞，将细胞收集到试管，PSB洗2次，离心弃上清液，悬浮沉淀的细胞，取50μL细胞悬液(含细胞数5×105～1×1010个）加入试管中，同时试管中加入1μL AnnexinVFITC试剂及5μL PI(0.25g/L）溶液，4℃下避光反应，10min后加冷缓冲液400μL，30min内上机检测。（3）脑垂体和外周血中VIP含量：采血2mL，125kU/mL肝素抗凝。应用放射免疫分析法 (RIA）测定脑垂体和外周血中VIP含量，按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件，采用One－Way ANOVA统计方法。计量资料以(）表示。

2 结果

2.1 各组胸腺细胞凋亡的形态学变化 （1）光镜观察结果：正常对照组胸腺组织学所见基本一致，胸腺无明显病理改变，胸腺细胞密集分布于胸腺皮质，细胞核呈圆形，深蓝色着染，胞质少，凋亡小体少见；核较大而着色浅的上皮性网状细胞散在于其间。过渡到胸腺髓质后，胸腺细胞数目明显减少，逐渐以上皮性网状细胞为主。CLP后36h各组大鼠胸腺皮质细胞稀疏，而髓质区细胞无明显减少，细胞分布反而较皮质区密集。皮质区凋亡细胞增多，核染色质浓缩、固缩，可见吞噬细胞碎片和凋亡小体的巨噬细胞。（2）透射电镜观察结果：正常对照组胸腺皮质内可见许多淋巴细胞，表面光滑，核大胞浆少，胞内细胞器少，线粒体无肿胀，粗面内质网发达，细胞核密度高。CLP致腹腔感染各组大鼠胸腺的淋巴细胞与上皮网状细胞均遭到不同程度的破坏。凋亡的胸腺淋巴细胞主要表现为细胞器增殖的凋亡细胞胞体变大，胞体内充满增殖的细胞器，以线粒体和粗面内质网为主；细胞器不增殖的凋亡细胞体皱缩，细胞形态不规则，核浆比例减少，核固缩，核染色质固缩成新月形或块状，线粒体和粗面内质网肿胀、增多。晚期细胞核崩裂为多个小球形块，经细胞膜出芽形成多个凋亡小体。

2.2 各组大鼠胸腺淋巴细胞凋亡率比较 见表1。与正常对照组相比，模型组和针刺组36h后大鼠胸腺细胞凋亡率均明显升高，(P＜0.05）；与模型组相比，针刺组胸腺细胞凋亡率明显降低(P ＜ 0.05）。

表1 各组胸腺细胞凋亡率、外周血和脑垂体中VIP含量比较 (）

表1 各组胸腺细胞凋亡率、外周血和脑垂体中VIP含量比较 (）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01

组 别n 凋亡淋巴细胞比例（%）脑垂体VIP含量（ng/L）外周血VIP含量（ng/L）539.60±34.50 335.60±27.30*433.10±52.90*△△20.10±2.20 43.60±3.20*31.50±3.20*△12 12 12正常对照组模型组针刺组22.30±1.50 12.30±1.30*16.20±1.20*△△

2.3 各组外周血和脑垂体中VIP含量变化 模型组和针刺组大鼠外周血和脑垂体中VIP含量均明显低于正常对照组 (P＜0.05）；但针刺组外周血和脑垂体中VIP含量均明显高于模型组(P ＜ 0.05），见表 1。

3 讨论

近年来随着脓毒症致病机制和宿主对脓毒症反应基因学基础研究的不断深入，人们对脓毒症的病理生理机制有了新的认识，已认识到机体免疫状态紊乱在脓毒症的发生、发展中起着重要作用。许多学者发现脓毒症患者往往伴有免疫抑制，包括迟发高反应的消失，清除感染的障碍和院内感染的发生率高，目前认为这是脓毒症治疗成功率低的重要原因。近年来得益于基础研究的进步，脓毒症免疫抑制发生的机制正逐步阐明。目前认为脓毒症免疫抑制与淋巴细胞凋亡加速关系密切。大量研究证实了淋巴细胞在本症发展中发生了凋亡[3,4]。本研究中，光镜和电镜证实在CLP 36h后各组胸腺细胞凋亡增多，胸腺细胞凋亡率明显升高。脓毒症时,由于细菌及内毒素的不断入侵,T淋巴细胞在受到外来抗原刺激后被激活,当出现异常的活化信号或非特异性的损伤时可导致淋巴细胞的凋亡。虽然淋巴细胞对外界的刺激异常敏感是细胞自身的一种保护机制,但淋巴细胞的过度凋亡会削弱抗体的产生，巨噬细胞的激活和抗原的递呈能力,继而直接和间接损害免疫功能,最终导致免疫抑制,减弱机体抗感染能力。脓毒症时，大量淋巴细胞凋亡是机体重要的应激反应，这种反应使许多生理条件下应该被淘汰的细胞不致由于脓毒症时免疫功能的紊乱而被错误地保留。研究发现，死亡的脓毒症患者中，其外周血淋巴细胞Bcl－2表达明显下降，凋亡的淋巴细胞明显增加[5]。脓毒症患者尸检研究也显示，许多参与获得性免疫反应的炎症细胞凋亡增加。研究发现抑制淋巴细胞异常凋亡可明显改善脓毒症的预后。Hotchkiss等[6]证实TAT－BH4和TAT－Bcl－xL缩氨酸能减轻脓毒症诱导的淋巴细胞凋亡并改善预后。Chung等[7]报道Fas－L缺陷脓毒症模型鼠黏膜B淋巴细胞凋亡减少且生存率提高；Schwulst等[8]发现使用竞争性CD40受体单克隆抗体能减少淋巴细胞凋亡，进而明显改善脓毒症预后。因此，脓毒症时纠正淋巴细胞异常凋亡已成为治疗脓毒症的新方向。

近年来一些临床和实验研究发现针灸对免疫功能有增强作用。虽然研究结果存在差异，但结果均证实，针灸对免疫系统具有双向良性调节作用，包括对白细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等细胞免疫均有促进和调节作用。陈永等[9]发现针灸足三里、关元等强壮要穴可以显著提高机体的免疫功能。谢延等[10]发现艾灸关元、足三里可在一定程度上改善衰老机体的免疫衰退或紊乱情况，增强免疫器官功能；提高淋巴细胞转化率,从多个途径增强或改善机体免疫功能。袁民等[11]发现艾灸中脘、神阙、关元穴能提高荷瘤小鼠的免疫力，提高CD3、CD4、CD4/CD8比率、NK细胞、LAK等细胞杀伤活性。高洪泉等[12]发现针刺足三里、关元能提高单核巨噬系统的吞噬功能，进而达到增强免疫功能的效果。

本研究通过电镜和光镜胸腺病理组织学和AnnexinV/PI双染色法检测胸腺细胞凋亡率证实电针足三里、关元穴能减轻脓毒症大鼠胸腺细胞的凋亡。研究还发现其机制可能与电针足三里、关元穴使脓毒症大鼠脑垂体和外周血中VIP的合成和释放增多有关。本研究为临床进一步应用针灸调节脓毒症患者的免疫功能提供了新的手段和实验依据。

[1]LeTulzo Y,Pangault C,Guilloux V,et al.Early circulating lymphocyte apoptosis in human septic shock is associated with poor outcome[J].Shock,2002,18(6）：487～494.

[2]林文注.实验针灸学 [M].上海：上海科学技术出版社,1999：283.

[3]Hotchkiss RS,Tinsley KW,Swanson PE,et al.Sepsis－induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+T lymphocytes in humans[J].J Immunol,2001,166(11）：6952～6963.

[4]Hiramatsu M,Hotchkiss RS,Karl E,et al.Cecal ligation and puncture CLP induces apoptosis in thymus,spleen,lung,and gut by an endotoxin and TNF independent pathway[J].Shock,1997,7(4）：247～253.

[5]Adrie C,Bachelet M,Vayssier Taussat M,et al.Mitochondrial membrane potential and apoptosis peripheral blood monocytes in severe human sepsis[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,164(3）：389～395.

[6]Hotchkiss RS,Mc Connell KW,Bullok K,et al.TAT－BH4 and TAT－Bcl－xL peptides protect against sepsis－induced lymphocyte apoptosis in vivo[J].J Immunol，2006,176(9）：5471 ～ 5477.

[7]Chung CS,Wang W,Chaudry IH,et al.Increased apoptosis in lamina propria B cells during polymicrobial sepsis is FasL but not endotoxin mediated[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,280(5）：G812～G818.

[8]Schwulst SJ,Grayson MH,DiPasco PJ,et al.Agonistic monoclonal antibody against CD40 receptor decreases lymphocyte apoptosis and improves survival in sepsis[J].J Immunol,2006,177(1）：557 ～565.

[9]陈永,申晓亮,唐中生，等.针灸强壮要穴对大鼠免疫功能的影响[J].上海针灸杂志,2006,25(10）：48～50.

[10]谢延,李丽红,吕明庄，等.艾灸关元、足三里对衰老小鼠免疫功能影响的实验研究 [J].贵阳中医学院学报,2003,25(2）：44～46.

[11]袁民,傅莉萍,陈雪华，等.艾灸对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J].针刺研究,2003,28(2）：115～118.

[12]高洪泉,朱梅.针刺老年大鼠“足三里”、“关元”穴对免疫影响的实验研究[J].针灸临床杂志，2002,18(5）：53～54.