肉苁蓉提取物对败血症大鼠急性肺损伤的影响

尹 刚 王贵林 余万桂

长江大学医学院(荆州 434023）

败血症是临床急危重症，寻求有效治疗药物一直是临床和基础研究的重大难题。败血症的中医病机是正虚邪实，单纯针对机体邪盛采取的攻下疗法是有效治疗措施之一，但仅局限于攻下治疗也难免失之偏颇，重视扶正补虚治疗同等重要。肉苁蓉是传统补益类中药，药理研究证实其具有增强细胞DNA合成率、抗氧自由基等保护功能。笔者实验观察肉苁蓉对败血症肺组织损伤的作用，以求为败血症扶正补虚治疗提供有效探索。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠40只，体质量200～250g，由华中科技大学实验动物中心提供，质检号：TJLA—2008—167。随机分为3组：生理盐水组8只，1g/mL肉苁蓉组12只，5g/mL肉苁蓉组12只。实验动物分别采用相应药物常规灌胃15d，每日2次 (肉苁蓉提取物由本院中药制剂室提供），给药剂量200mg/kg。实验动物均按文献[1]方法在盲肠结扎穿孔后12min采集标本。

1.2 大鼠肺组织学检查 每组取动物肺左叶少许，经10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后，用普通光学显微镜观察，并在此基础上取肺组织制成1mm3用25%戊二醛溶液固定，然后固定于1%四氧化锇液中，乙醇、丙酮脱水，经Epon 81包埋，制备超薄切片后，行铀－铅双重染色，用透射电镜观察。

1.3 大鼠肺组织湿/干重比、肺泡灌洗液中细胞计数比及蛋白含量测定 开胸取出肺脏，称湿重后置烤箱 (80℃）烤至衡重，称干重，计算湿/干重比。另一批大鼠开胸后行肺泡灌洗，灌洗液在显微镜下行细胞计数、细胞分类。考马氏亮蓝法测定蛋白含量，计算肺通透指数 (肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白，LPI）。

1.4 大鼠肺血管通透性(PVP）变化 按照Zhou等[2]介绍的方法，在给药后，各组动物均在作盲肠结扎穿孔术同时股静脉注射伊蓝50mg/kg。开胸取出肺脏，剪去周围组织，将肺浸泡在甲酰胺溶液中(甲酰胺用量按20mg/100g体质量），置45～50℃温箱中温育72h，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，用紫外分光光度计于620nm处进行比色，根据标准曲线计算伊蓝含量来测定PVP的变化。

1.5 大鼠肺组织丙二醛 (MDA）的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA）法[3]测定MDA活性。50mL待测标本加4mL 1.67mol/L的硫酸、0.541%磷钨酸，混匀，3000r/min离心10min，沉淀再同上处理1次，然后加1mL双蒸水、1mL TBA溶液，95℃水浴60min，用5mL正丁醇提取，四乙氧基丙烷作为标准品，终浓度为1nmol/L，荧光分光度计于532nm处测定吸光值。

1.6 大鼠肺组织超氧化物歧化酶(SOD）的测定 按文献[4]方法，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性 (试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。

1.7 大鼠肺组织髓过氧化物酶 (MPO）测定 取肺组织于等渗盐水中尽量洗净残血，置于含0.5%十六烷基三甲基溴化铵的磷酸缓冲液(pH6.0）中制成5%的匀浆，按试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 各组肺组织湿/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量比较 见表1。生理盐水组肺湿/干重比显著高于肉苁蓉组(P＜0.05或0.01），肉苁蓉组肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量明显低于生理盐水组(P＜0.05或0.01），且随着给药质量浓度增加呈现显著降低。

表1 各组大鼠肺组织湿/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量的比较 (）

表1 各组大鼠肺组织湿/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量的比较 (）

与生理盐水组比较，*P＜0.01**P＜0.01。下同

组 别生理盐水组1g/mL肉苁蓉组5g/mL肉苁蓉组肺组织湿/干重比4.58±0.20 4.28±0.21*4.17±0.16**细胞计数比（%）55.21±10.24 31.34±12.46*27.32±8.28**蛋白含量(mg/L）254.88±95.42 62.23±18.96*46.16±11.34**

2.2 各组大鼠肺组织形态学改变的比较 大体观察：生理盐水组肺脏体积明显增大，呈暗红色，表面可见不同程度充血水肿，边缘部分大量肺梗死灶；肉苁蓉组肺脏呈浅红色，表面轻度充血水肿，未见明显肺梗死灶。光镜观察示，生理盐水组见肺泡、肺间质充血水肿，肺泡腔内大量弥漫性中性粒细胞浸润，部分有脓肿形成，可见不同程度的肺不张、坏死、代偿性肺气肿、血栓及类似透明膜形成。肉苁蓉组上述病变明显减轻。生理盐水组肺泡上皮细胞肿胀，板层小体排空现象明显，形成大空泡，毛细血管内皮细胞肿胀，内皮细胞之间连续损伤，细胞间隙增宽，毛细血管及肺泡基底膜疏松，增宽，不规则增厚，厚薄不均。肉苁蓉组肺泡上皮细胞肿胀不明显，板层小体排空减轻，形成空泡数量少，体积小，毛细血管内皮细胞之间连接接近正常，基底膜轻度疏松，不规则增厚。5g/mL肉苁蓉组较1g/mL肉苁蓉组肺组织形态学改变范围更小，肺损伤程度更轻。

2.3 各组大鼠LPI和PVP的比较 见表2。生理盐水组LPI和PVP明显高于肉苁蓉组 (P＜0.05或0.01），肉苁蓉组LPI和PVP降低，具有显著量效关系。

2.4 各组大鼠肺组织MDA、SOD、MPO活性的比较 见表3。生理盐水组肺组织中MDA含量显著高于肉苁蓉组，而肉苁蓉组肺组织中SOD活性和MPO活性显著增高(P＜0.05或0.01）。

表2 各组大鼠LPI和PVP比较 (）

表2 各组大鼠LPI和PVP比较 (）

组 别生理盐水组1g/mL肉苁蓉组5g/mL肉苁蓉组LPI(×10－3）5.58±1.12 2.53±0.37*1.86±0.21**PVP（mg/L）6.54±0.86 3.87±0.72*3.04±0.40**

表3 各组大鼠肺组织MDA、SOD、MPO活性比较 (）

表3 各组大鼠肺组织MDA、SOD、MPO活性比较 (）

组 别生理盐水组1g/mL肉苁蓉组5g/mL肉苁蓉组MDA(nmol/mg）3.66±0.63 1.55±0.44*0.55±0.15**SOD(NU/mg）78.15±10.99 89.60±5.63*102.39±3.32**MPO(U/g）1.55±0.32 0.48±0.13*0.33±0.12**

3 讨论

多器官衰竭是败血症后期病情不可逆转和死亡率高的根本原因[5]，保护器官功能对降低败血症临床高死亡率具有重要意义。肺作为多器官衰竭的首发器官，1/3败血症患者死于急性肺损伤(ALI）和急性呼吸窘迫综合症(ARDS）。ALI的主要病理生理机制是大量中性粒细胞在肺组织内聚集和活化，并与血管内皮细胞黏附的同时，转移单电子的还原型辅酶Ⅱ氧化酶浓度增高而引起呼吸爆发，产生大量氧自由基，通过较强的氧化作用引起细胞膜和膜性结构的损害和功能障碍[6]。脂质过氧化物反映组织中氧自由基的变化，与肺损伤的程度有直接的量相关[7]。在机体的酶与非酶抗自由基氧化系统中，SOD的活性与组织损伤度保持良好的相关性[7]。肉苁蓉组MDA和SOD活性与生理盐水组比较，差异有统计学意义。肉苁蓉具有增强免疫功能，抗衰老，增强细胞DNA合成率等作用。实验结果表明，肉苁蓉组肺系数、PLT、肺泡灌洗液中性粒细胞比例，肺血管通透性均显著下降，肺组织MDA活性下降、SOD显著上升，MPO活性下降。同时形态学观察发现肺组织损伤程度明显减轻，中性粒细胞浸润减少，且5g/mL肉苁蓉组较1g/mL肉苁蓉组肺损伤程度更轻，存在良好的量效关系。提示肉苁蓉对ALI具有较显著的保护作用。其机制可能为：（1）抑制炎性细胞肺内迁移，减少中性粒细胞等被激活产生的氧自由基，使生物膜得到保护；（2）促进核酸和蛋白质合成，对肺损伤具有保护作用；（3）增强吞噬细胞免疫功能，减轻内毒素造成的肺组织损伤。该实验结果为临床败血症急性肺损伤扶正补虚治疗提供了实验基础。

[1]金惠铭.盲肠结扎穿孔术后的败血症模型 [J].中国病理生理杂志，1990，6(2）：126 ～ 127.

[2]Zhou WG，Mc Collum MO，Levine BA，et al.Role of platelet activating factor in paneretltis associated acute lung injury in the rat[J].Am J Pathol，1992，140：971 ～ 979.

[3]汪谦，朱晓峰，赵西龙.现代医学实验方法 [M].北京：人民卫生出版社，2007：508.

[4]张秀明，李健斋，魏明竟.现代临床生化检验学 [M].北京：人民军医出版社，2008：896.

[5]罗正曜.休克学[M].天津 ：天津科学技术出版社，2008：345.

[6]Manthous CA，Hall JB.Samsel RW.Endotoxin in humm disease，part 2Biologic effect and clinical evaluation of anti－endotoxln theries[J]Chest，2003，104：1872.

[7]Ward PA，Till GO，Hatherill JT，et al.Systeznic complement activation luninjury and products oflipid peroxidation[J].J Clin Invest，2005，76(2）：571.