降解亚硝酸盐优势菌的筛选研究

2010-11-27胡静荣华中科技大学生命科学与技术学院湖北武汉430074

长江大学学报(自科版) 2010年11期

关键词：菌液亚硝酸盐菌落

胡静荣 (华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430074)

降解亚硝酸盐优势菌的筛选研究

胡静荣
(华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉 430074)

为了筛选出繁殖速度快、降解亚硝酸盐能力强、经济成本低的优势菌种，取不同河流的淤泥样本分别放入降解亚硝酸盐的富集培养基中培养、分离、纯化。结果筛选出1株降解亚硝酸盐能力较强的菌，可以在24 h内降解养殖水体容纳亚硝酸盐临界值的500倍。

亚硝酸盐；优势降解菌；筛选

随着规模化、高密度水产养殖业的迅速发展及工业废水和生活污水的大量排放，生态环境遭到破坏，严重影响了渔业的发展[1]。据报道，养殖水体中容纳亚硝酸盐临界值为0.2 mg/L，在0.5 mg/L时会引起鱼类死亡或患病，高于0.8 mg/L会引起大批死亡；河蟹、对虾育苗水质的亚硝酸盐氮应控制在0.1 mg/L以下，在0.3 mg/L时轻度死亡，超过0.5 mg/L将引起大量死亡[2]。为了解决水体亚硝酸盐含量超标导致鱼虾死亡问题，国内外科研工作者做了大量工作。传统使用抗生素和其他化学药物降解亚硝酸盐的方法不仅收效甚微，而且还引发了一系列环境和社会问题。近年来，人们开始尝试在养殖水体中使用微生物制剂来改善养殖水体的生态环境，从而降低亚硝酸盐的含量，如硝化细菌、枯草芽孢杆菌等[3，4]在许多国家已经取得了显著成效。本研究通过定向筛选、富集培养，以期从淤泥中筛选出繁殖速度快、降解亚硝酸盐能力强、经济成本低的优势菌种，以期为生产工业提供优质材料。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)淤泥样品来源于湖北省荆州市古城护城河周边的污水渠和鱼塘。

(2)培养基亚硝酸盐液体培养基制作方法：将NaNO20.1 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、葡萄糖 0.2 g、铁盐母液0.1 mL(亚铁盐母液：0.557 g FeSO4，0.745 g EDTA-Na2，加蒸馏水定容至10 mL)加蒸馏水定容至1 L，调pH为7.2，灭菌待用。在液体培养基中加入7 g琼脂粉，定容至1 L，制成固定培养基，灭菌待用。

1.2 方法

(1)富集培养将淤泥样品分别放于装有100 mL亚硝酸盐液体培养基中，在37 ℃、170 r/min的恒温摇床上预备培养，每天检测预备培养液中亚硝酸盐的降解情况。从已降解完毕的预备培养液中对应取出1 mL菌液转入100 mL亚硝酸盐液体培养基中进行“第一次培养”，48 h后进行检测。依次类推，进行“第二次培养”、“第三次培养”，共6次培养，使其降解亚硝酸盐的能力稳定并逐渐纯化获得更多的优势菌。

本研究采用重氮化偶合法检测亚硝酸盐[5，6]，自定义Q表示每次继代培养48 h，单位体积的菌量降解单位体积培养基中亚硝酸盐的能力。

式中，DC0表示未接菌培养基的光密度值；DCi表示接菌48 h后培养基的光密度值；M表示接入的菌液量(mL)；N表示培养基的体积(mL)。若P值越大，表示降解能力越强，降解亚硝酸盐优势菌纯度越高；P值越小，表示降解能力越弱，降解亚硝酸盐优势菌纯度越低。

(2)菌的纯化取第六次培养后的菌液5 μL，用无菌水稀释至200 mL后均匀地涂抹在亚硝酸盐固体培养基平板上，置于37 ℃的恒温培养箱中24 h，选取生长较大的菌落进行划线培养，每个菌落2次重复划平板，置于 37 ℃的恒温培养箱中24 h。重复中一平板采用重氮化偶合反应法进行染色，观察显色反应，若显示无色表明亚硝酸盐完全降解，再对应从重复中另一平板上挑选相应菌落进行液体培养，并保存备用。

1.3 数据处理

采用Excel软件对所得数据进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 优势菌的富集培养

通过富集培养，筛选出2个降解亚硝酸盐效果理想的混合菌群，分别命名为“一号菌群”和“二号菌群”。从预备培养液中分别取1 mL接入新的培养基进行“第一次培养”，依次类推进行“第二次培养”、“第三次培养”直到“第六次培养”，结果均是“二号菌群”的降解能力强于“一号菌群”，并且随着继代培养次数的增加，“二号菌群”的降解能力越强(图1)。此外，随着培养次数的增加，2个菌群降解亚硝酸盐的能力均增强，且经“第五次培养”后降解能力急剧上升。