紫菜薹BcMF4基因的克隆及其RNAi植物表达载体的构建

刘乐承，林小芳 (长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

紫菜薹BcMF4基因的克隆及其RNAi植物表达载体的构建

刘乐承，林小芳
(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

根据普通白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis,syn.B.rapassp.chinensis)雄性不育相关基因BcMF4序列设计一对特异引物，从紫菜薹(B.campestrisssp.chinensisvar.purpuraria)中克隆出了大小为710 bpBcMF4基因片段。采用Gateway技术，构建了BcMF4基因RNA干涉(RNA interference,RNAi)植物表达载体。为下一步通过沉默BcMF4基因，明确其对紫菜薹花粉发育和雄性不育的影响奠定了基础。

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)；BcMF4基因；克隆；RNAi(RNA interference)；表达载体

BcMF4(BrassicacampestrisMale Fertility 4)基因是从普通白菜(B.campestrisssp.chinensisvar.communisTsenetLee)核雄性不育两用系中分离得到的一个雄性不育相关的隐性基因[1]。目前，已经从十字花科植物11个物种中克隆出了BcMF4的同源基因[2]，而且已经证明，在菜心(B.campestrisssp.chinensisvar.parachinensis(Bailey) TsenetLee)、拟南芥(Arabidopsis)中，BcMF4与花粉发育有着密切关系[3,4]。然而，至今还没从紫菜薹(B.campestrisssp.chinensisvar.purpuraria)克隆出BcMF4的同源基因。紫菜薹是十字花科芸薹属作物，原产我国，营养价值极高[5]。紫菜薹早熟品种和中晚熟品种分别于国庆、元旦、春节前后大量上市，深受大众的喜爱[6]。本研究拟从紫菜薹中克隆出BcMF4后，采用Gateway技术构建其RNA干涉(RNA interference,RNAi)[7]植物表达载体，旨在为下一步通过沉默该基因明确其对紫菜薹雄性不育的影响及分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

田间种植‘十月鲜’紫菜薹，开花期取2.5 mm以上的花蕾[2～4]，立即投入液氮中，带回实验室-75 ℃保存备用。

T4-DNA连接酶、pGEM-T-easy-vector 购自Promega公司；1 kb DNA Ladder Marker、100-bp DNA Ladder和VITGENE DNA回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Taq DNA Polymerase购自Fermentas公司；B型小量质粒快速提取试剂盒购自背景博大泰恒生物技术有限公司；Gateway®BP ClonaseTMII购自Invitrogen公司。PCR引物委托湖北省武汉鼎国生物技术有限公司合成。IPTG、X-gal、氨苄青霉素、利福平、链霉素等购自北京索莱宝科技有限公司。常规试剂均为进口或国产分析纯。

大肠杆菌(E.coli)DH5a菌株、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404工程菌株由长江大学许峰博士惠赠；pHGRV质粒为华中农业大学叶志彪教授惠赠。

1.2 目的片段的克隆

称取1.0～1.5 g紫菜薹花蕾，采用CTAB法[8]提取DNA，0.7%的琼脂糖凝胶电泳检查、分子检测仪检测质量。根据文献[4]设计1对引物(B4-1：5’-GCT GGATCC ATC AAG AAG TCC CTT AAC AAC C-3’；B4-2：5’-GCT TCTAGA ACA TCA TCG AAG CAT CAC C-3’)，以提取的紫菜薹DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，63.6 ℃退火45 s，72 ℃延长45 s，共30个循环；72 ℃延长10 min；4 ℃保存；PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳分离后，用手术刀切下含目的片段的胶块，采用VITGENE DNA胶回收试剂盒进行回收。取适量的回收DNA与50 ng pGEMRR-T-Easyv-ector在T4连接酶作用下连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株感受态细胞。在LB/Amp/IPTG/X-gal筛选平板上筛选重组子，挑选白色菌落经LB液体培养后，用B型小量质粒快速提取试剂盒提取质粒DNA(按说明书进行)。取适量质粒DNA为模板，以B4-1、B4-2为引物，进行PCR扩增鉴定。

1.3 RNAi表达载体的构建

以带有目的基因片段的重组质粒为模板，用aBttI+和aBttII+进行第一轮PCR扩增(50 μL PCR反应液中含有引物10 pmol/L，扩增条件为：95 ℃ 2 min后，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，5个循环)，取10 μL反应物至含有40 pmol/L aBtt 通用引物的40 μL PCR反应液中进行第二轮扩增(95 ℃ 1 min后，94 ℃ 15 s，45 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，5个循环；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，15个循环，68 ℃ 延伸5 min)，PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶分离检测，回收目的片段。在5 μL BP缓冲液中，依次加入100 ng纯化的PCR产物和100 ng带有attP位点的pHGRV质粒DNA，混匀，加入4 μL BP Clonase，25 ℃反应过夜。加入1 μL蛋白酶K，37 ℃ 10 min终止反应。取反应物热击法转化大肠杆菌DH5a，Str 50 mg/L的LB固体平板筛选阳性克隆。以pHGRV上35S与Intron序列为引物对阳性克隆进行PCR检测[9]。提取阳性重组子质粒，CaCl2转化法转化农杆菌LBA4404[10]，在含Rif 50 mg/L、Str 80 mg/L的LB平板上筛选阳性克隆，菌落PCR检测验证，定名为pHGRV-B4。

2 结果与分析

2.1 目的片段的获得

提取的紫菜薹基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳(图1)检测后，分子检测仪器检测发现DNA含量为1.86 mg/mL，D260=0.186，D280=0.091，D280/D260=0.49，表明提取的紫菜薹基因组DNA质量较好。以B4-1、B4-2为引物对其进行PCR扩增，得到的目的片段为单一条带，大小为710 bp左右(图2)，与预期吻合。连接到pGEM-T-Easy-vector载体上后，PCR验证大小为710 bp左右；阳性克隆测序结果证实所扩增的条带为BcMF4基因片段。

M为Marker；A、B为DNA片段图1 紫菜薹基因组DNA电泳图Figure1 Electrophoresisofpurplecai⁃taigenomeDNAM为Marker；A为扩增的BcMF4片段图2 BcMF4基因PCR扩增产物电泳图Figure2 ElectrophoresisofBcMF4fragmentofPCRamplification

2.2 RNAi表达载体的获得

M为Marker;A、B为PCR扩增片段图3 RNAi表达载体的PCR检测电泳图Figure 3 Electrophoresis of RNAi expression vector by PCR detection

经过两轮PCR反应获得带有aBtt位点的目的基因BcMF4基因片段，然后在BP Clonase作用下，与载体pHGRV上的attP位点发生重组，将目的基因片段整合到pHGRV上，最终获得了带有反向重组BcMF4基因的RNAi植物表达载体(图3)。

3 讨论

芸薹属作物是杂种优势利用最为普遍的一类作物，而雄性不育系是白菜类等芸薹属作物杂种优势利用的最理想方式，因而其雄性不育的选育及其应用基础的研究深受人们重视。随着分子生物学实验手段日臻完善，从分子水平上阐明芸薹属植物雄性不育的机理已成为可能。从雄性不育的遗传基础着手，了解花粉发育相关的基因以及抑制花粉发育的基因，是揭示雄性不育产生的机理的有效途径。但迄今为止，从芸薹属植物中分离的花粉、花药特异表达基因为数不太多，且多数基因功能尚不清楚。从普通白菜核雄性不育两用系中成功分离得到雄性不育相关的隐性基因BcMF4后，已经从十字花科植物11个物种中克隆出了同源基因，而且已经证明，在拟南芥、菜心中与花粉发育有着密切关系[3,4]。本研究从紫菜薹克隆出了BcMF4基因的同源片段，为下一步研究奠定了基础。当然，还需通过RACE等方法克隆出BcMF4基因的全序列，以进一步证实所克隆片段的正确性。

RNAi现象普遍存在于植物和动物中，这一现象一经发现马上就引起了人们的高度重视，并迅速发展成为一种强大的“基因沉默”技术，广泛应用于各种生物的基因功能鉴定和功能基因表达调控领域[11]。RNAi的关键在于表达载体的构建。但是，以往RNAi植物表达载体的构建十分繁琐，耗时费钱[3,4]。本研究采用Gateway技术，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，操作简便，反应条件易于控制，阳性克隆通过PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳即可检测，获得的表达载体能直接用于农杆菌介导的植物转化，从而为下一步通过沉默BcMF4基因，明确其对紫菜薹花粉发育和雄性不育的影响奠定了基础。

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[3]刘乐承，向 珣，曹家树．白菜雄性不育相关基因BcMF4基因功能的RNAi验证[J]．遗传，2006，28(11)：1428～1434．

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2010-10-16

湖北省教育厅重点项目(2007ABA386)

刘乐承(1964-)，男，湖北洪湖市人，农学博士，教授，主要从事园艺植物遗传育种的教学与研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.04.013

Q785

A

1673-1409(2010)04-S044-03