新癀片对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞凋亡的影响

吴葆莹 吴崇旭 薛承锐

·论著·

新癀片对急性胰腺炎大鼠胰腺细胞凋亡的影响

吴葆莹 吴崇旭 薛承锐

目的观察新癀片对急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺细胞凋亡和胰腺组织Bcl-2、c-Myc蛋白表达的影响，并探讨其作用机制。方法90只Wistar大鼠按完全随机法分为对照组、AP组和新癀片治疗组。采用胆胰管逆行注射5%牛黄胆酸钠1 ml/kg体重方法制备AP模型。治疗组于制模后30 min按480 mg/kg体重的剂量予新癀片水溶液灌胃。术后6、12、24 h分批处死大鼠，检测血淀粉酶活性，观察胰腺病理变化，TUNEL法检测胰腺细胞凋亡，Western blotting法检测胰腺组织Bcl-2、c-Myc蛋白表达。结果对照组12 h点的血淀粉酶活性、胰腺病理评分、凋亡指数、胰腺组织Bcl-2和c-Myc蛋白表达量分别为(1927±186)U/L、0、0.59±0.12、0.406±0.112、0.185±0.046；AP组分别为(5611±473)U/L、2.65±0.56、3.80±0.91、0.282±0.082、0.339±0.076；治疗组分别为(4572±400)U/L、2.40±0.75、7.15±0.86、0.220±0.068、0.302±0.090。AP组和治疗组的淀粉酶活性、胰腺病理评分、凋亡指数、c-Myc蛋白表达量均显著高于对照组(P值均<0.05)，而Bcl-2蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)。与AP组比较，治疗组的淀粉酶活性、胰腺病理评分、胰腺组织Bcl-2蛋白表达量均显著降低(P值均<0.05)，凋亡指数显著增高(P<0.05)，c-Myc蛋白表达量无显著变化。结论新癀片可通过下调Bcl-2蛋白表达、诱导AP早期胰腺细胞凋亡，从而减轻胰腺炎症反应。

胰腺炎； 细胞凋亡; 新癀片； Bcl-2； c-Myc

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种发病急、并发症多、进展快、病死率高的疾病，因此深入研究AP发病机制以及寻求有效的治疗手段具有重要的理论意义和临床应用价值。本研究观察中药制剂新癀片对AP大鼠的保护作用，并探讨其作用机制。

材料和方法

一、实验分组

Wistar大鼠购自中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，批号SCXK津2008-0001，清洁级。按完全随机法分为对照组、急性胰腺炎(AP)组和新癀片治疗组，各30只。采用胆胰管逆行注射5%牛黄胆酸钠1 ml/kg体重方法制备AP模型；对照组大鼠开腹后翻动十二指肠数次。治疗组于制模后30 min按480 mg/kg体重的剂量予新癀片水溶液灌胃，对照组和AP组予等量蒸馏水灌胃。术后6、12、24 h分批处死大鼠。取血及胰腺组织。

二、方法

1．血淀粉酶检测：应用全自动生化分析仪。

2．胰腺病理学检查：取部分胰腺组织，常规病理检查。由病理科医师盲法阅片。并参照Zhou等[1]的评分标准进行评分。

3．胰腺细胞凋亡检测：采用TUNEL法。每张切片计数7个高倍视野的阳性细胞数和总细胞数。凋亡指数(AI)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

4．胰腺组织Bcl-2和c-Myc蛋白检测：采用 Western blotting法。以目的蛋白与内参蛋白条带的吸光度积分值的比值表示蛋白相对表达量。

三、统计处理

结 果

一、一般情况

对照组状况较好，无死亡。AP组有呼吸急促、竖毛、懒动、精神萎靡、反应迟钝、拒食等表现，术后死亡10只。治疗组一般情况较AP组好，术后死亡5只，较AP组显著降低(P<0.05)。

二、血清淀粉酶变化

AP组和治疗组的血淀粉酶均较对照组显著增高(P<0.05)，于6 h达峰值；治疗组6、12 h的淀粉酶又较AP组同时点显著降低(P<0.05，表1)。

三、胰腺病理变化

对照组胰腺结构正常(图1a)。AP组胰腺间质水肿，炎细胞浸润，腺泡小叶结构破坏，胰腺组织出血、凝固性坏死及脂肪坏死(图1b)。治疗组较AP组上述病变有不同程度减轻，其中6 h组炎症减轻最为明显(P<0.05，图1c)。各组胰腺病理评分见表1。

四、胰腺细胞凋亡变化

对照组罕见细胞凋亡(图2a)。AP组6 h时凋亡细胞最多，以后显著减少(P<0.05，图2b)，AI值均显著高于对照组(P<0.05，表1)。治疗组凋亡细胞数较AP组增加，6、12 h的AI值有显著差异(P<0.05，表1，图2c)。

五、胰腺组织Bcl-2和c-Myc蛋白表达的变化

AP组Bcl-2蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05)；治疗组6、12 h时的Bcl-2蛋白表达又较AP组显著降低(P<0.05)。AP组c-Myc蛋白表达较对照组显著增加(P<0.05)；治疗组的c-Myc蛋白表达与AP组无显著差异(表2，图3)。

表1 各组淀粉酶、胰腺病理评分和凋亡指数的变化

注：与对照组比较，aP<0.05；与AP组比较，bP<0.05

表2 各组Bcl-2和c-Myc蛋白表达量的变化

注：与对照组比较：aP<0.05；与AP组比较，bP<0.05

图1对照组(a)、AP组(b)和治疗组(c)12 h的病理改变(HE ×200)

图2对照组(a)、AP组(b)和治疗组(c)12 h的细胞凋亡(TUNEL ×200)

1～3：对照组6、12、24 h；4～6：AP组6、12、24 h；7～9：治疗组6、12、24 h

图3Bcl-2和c-Myc蛋白的表达(Western blotting)

讨 论

AP属于中医学“结胸”和“阳明腑实证”， 其病变关键是实热血瘀，治疗上以清热解毒、活血化瘀和通腑泻下为主[2-3]。新癀片是在传统药物“八宝丹”组方基础上研制而成，其主要组分为肿节风、田七、牛黄、珍珠层粉等，主治各种炎症、痛症[4]。其主要成分之一肿节风，含有延胡索酸、黄酮苷内酯等多种成分，具有清热解毒、抗菌消炎的作用。另一主要成分田七具有活血化瘀、消肿止痛的功效。本研究结果显示，新癀片治疗组的淀粉酶活性显著降低，胰腺组织损害明显减轻，说明新癀片对缓解AP早期病程的进展具有较好的效果。

近年来的研究表明，细胞凋亡的程度与AP的严重程度呈负相关[5-6]。本结果显示，AP组AI显著高于对照组，以6 h时最高，治疗组6、12 h时的AI值又较AP组同时间点显著增加，表明新癀片能诱导AP早期胰腺细胞凋亡，从而减轻病情的严重程度。

细胞凋亡的发生机制非常复杂，其中Bcl-2及c-Myc蛋白均可诱导细胞发生凋亡。本实验AP组的Bcl-2蛋白表达较对照组降低，c-Myc蛋白表达增加，新癀片治疗后Bcl-2的表达更加降低，而c-Myc蛋白表达无明显改变，提示新癀片可能是通过下调Bcl-2蛋白表达诱导胰腺细胞发生凋亡的。

[1] Zhou X,Xue C.Ghrelin inhibits the development of acute pancreatitis and nuclear factor kappa B activation in pancreas and liver.Pancreas,2009,38:752-757.

[2] 胡占良,吕志武,张新宇,等.参附注射液对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障保护作用的研究.中华胰腺病杂志,2008,8:24-27.

[3] 姚圣华,朱阳春,李淑德.清胰汤及生大黄灌肠治疗重症急性胰腺炎最佳应用时间探讨.中华胰腺病杂志,2008,8:324-325.

[4] 朱蔚云,杨炜青,阮小贞,等.新癀片对荷S180小鼠的肿瘤生长及免疫功能的影响.中国药房,2005,16:98-100.

[5] Fortunato F,Bürgers H,Bergmann F,et al.Impaired autolysosome formation correlates with Lamp-2 depletion:role of apoptosis,autophagy,and necrosis in pancreatitis.Gastroenterology,2009,137:350-360.

[6] Li ZD,Ma QY,Luo YH.Expression of survivin gene in a rat model of acute pancreatitis.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2009,29:1141-1143.

2009-12-12)

(本文编辑：屠振兴)

EffectofXinhuangPianonpancreaticapoptosisinratwithacutepancreatitis

WUBao-ying,WUChong-xu,XUECheng-rui.

DepartmentofSurgeryIntegratedTraditionalandWesternMedicine,GeneralHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China

Correspondingauthor:WUChong-xu,Email:0e25@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of Xinhuang Pian on pancreatic apoptosis and the protein expression of Bcl-2 and c-Myc in rat with acute pancreatitis (AP).Methods90 Wister rats were randomly divided into 3 groups, including control group, AP group and Xinhuang Pian treatment (XP )group. AP model was induced by pancreaticobiliary injection of 5% sodium taurocholate (1 ml/kg weight). Rats in XP group were given Xinhuang Pian solution (480 mg/kg weight) lavage 30min after AP induction, The rats were sacrificed at 6,12, 24 h after AP induction, and serum amylase levels were determed, pancreatic pathological change was observed; apoptosis was determined by TUNEL method. The determination of Bcl-2 and c-Myc protein expression was performed by Western blot.Results12 h after AP induction, serum amylase, pancreatic pathological scores, apoptotic indexes and the protein expression of Bcl-2 and c-Myc were (1927±186)U/L, 0, 0.59±0.12, 0.406±0.112, 0.185±0.046 in control group; (5611±473)U/L, 2.65±0.56, 3.80±0.91, 0.282±0.082, 0.339±0.076 in AP group; and (4572±400)U/L, 2.40±0.75, 7.15±0.86, 0.220±0.068, 0.302±0.090 in XP group. The levels of serum amylase, pancreatic pathological scores, apoptotic indexes and the protein expression of c-myc in AP and XP group were all significantly higher than those in control group (P<0.05), while the protein expression of Bcl-2 was significantly lower than that in control group (P<0.05). Compared with AP group, the levels of serum amylase, pancreatic pathological scores, protein expression of Bcl-2 were all significantly lower in XP group (P<0.05), but the apoptotic indexe was significantly higher (P<0.05), and there was no significant change of expression of c-Myc protein.ConclusionsXinhuang Pian may induce the pancreatic apoptosis through down-regulating Bcl-2 protein expression, and result in the alleviation of pancreatic inflammatory reaction.

Pancereatitis; Apoptosis; Xinhuang Pian; Bcl-2; c-Myc

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.012

300052 天津，天津医科大学总医院中西医结合外科(吴葆莹、薛承锐)，急诊科(吴崇旭)

吴崇旭，Email:0e25@sina.com