胰腺癌中GLI1、PTCH1 mRNA的表达及其与临床指标相关性分析

郭杰芳 高军 李兆申 龚燕芳 金晶 满晓华 吴红玉

·论著·

胰腺癌中GLI1、PTCH1 mRNA的表达及其与临床指标相关性分析

郭杰芳 高军 李兆申 龚燕芳 金晶 满晓华 吴红玉

目的检测胰腺癌组织中GLI1、PTCH1 mRNA的表达情况,探讨其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR方法检测35例胰腺癌组织及27例癌旁正常胰腺组织中GLI1、PTCH1 mRNA的表达，并分析它们与相关临床指标的关系。结果胰腺癌组织GLI1 mRNA相对表达量为1.12～3.65，中位数为1.19；PTCH1 mRNA相对表达量为1.82～4.36，中位数为2.36。癌旁正常胰腺组织的GLI1 mRNA相对表达量为0.23～2.76，中位数为0.87；PTCH1 mRNA相对表达量为1.11～2.17，中位数为0.58。癌组织GLI1、PTCH1 mRNA的表达量均显著高于癌旁正常胰腺组织(P<0.05)，且GLI1 mRNA与PTCH1 mRNA的表达水平呈正相关(r=0.532，P<0.05)；GLI1 mRNA的表达水平与胰腺癌的分化程度及淋巴结转移相关(P<0.05)。结论GLI1、PTCH1基因参与胰腺癌的发生；GLI1的表达与胰腺癌的侵袭及淋巴结转移有关。

胰腺肿瘤； GLI1； PTCH1； 肿瘤侵袭； 肿瘤转移

目前研究发现，Hedgehog信号通路(Hh信号通路)的异常激活与胰腺癌的发生发展密切相关[1-2]。PTCH1、GLI1分别是该通路的跨膜蛋白质受体及下游的转录激活因子，两者在该通路的信号转导中发挥着非常重要的作用。本实验检测胰腺癌组织中GLI1、PTCH1 mRNA的表达情况，分析其与胰腺癌临床指标的相关性，为临床开发诊断与治疗胰腺癌的新方法提供一定实验依据。

材料和方法

一、临床资料

收集2004年4月至2006年5月我院外科手术切除并经术后病理证实的35例胰腺癌患者。所有病例均有完整的手术记录及临床资料。其中男23例，女12例，年龄42～75岁，平均60岁。肿瘤最大径≤3 cm 15 例, >3 cm 20 例；高分化13例，中低分化22例；淋巴结转移17例，未转移18例；远处转移14例，无远处转移21例。术中获取的胰腺癌组织立即置于液氮冻存，同时获取的27例癌旁正常胰腺组织(距肿瘤边缘>5 cm)也置液氮冻存作为对照。本研究经上海第二军医大学附属长海医院道德伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

二、GLI1、PTCH1 mRNA的检测

取冻存的胰腺癌或癌旁组织标本约100 mg，研磨成粉末状，按3S Trizol总RNA抽提试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书抽提组织总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的纯度与浓度。按逆转录试剂盒(上海晶美生物工程有限公司)说明书逆转录成cDNA。再在Lightcycler 2.0 system 荧光定量PCR仪(Roche Diagnostics Ltd)上行实时定量PCR检测GLI1 mRNA 及PTCH1 mRNA。根据GLI1及PTCH1序列自行设计引物， GLI1上游引物为5′-TGTGTATGAAACTGACTGCCG-3′，下游引物为5′-CCCAGTGGCACACGAACTC-3′，产物长度125 bp；PTCH1上游引物为5′-TGTGCGCTGTCTTCCTTCTG-3′，下游引物为5′-CACGGCACTGAGCTTGATTC-3′，产物长度119 bp；内参照β-actin上游引物为5′-GCCATCCTGCGTCTG-3′，下游引物为5′-TGGGCACCGGAACCGCT-3′，产物长度260 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反应条件： 95℃ 30 s， 95℃ 5 s、55℃ 20 s、72℃ 20 s，共40个循环。融解曲线分析 95℃ 0 s、65℃ 15 s、95℃ 20 s。以相对定量法(ΔΔCT法)计算GLI1、PTCH1 mRNA的表达量。

三、统计学分析

采用SPSS 14.0软件进行统计。两组目的基因表达量的比较采用Mann-WhitneyU检验；相关性分析采用Spearman秩相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、胰腺癌及癌旁正常组织GLI1、PTCH1 mRNA的表达

35例胰腺癌标本及27例癌旁正常组织均可检测到GLI1、PTCH1 mRNA的表达。胰腺癌组织GLI1 mRNA相对表达量为1.12～3.65，中位数为1.19；PTCH1 mRNA相对表达量为1.82～4.36，中位数为2.36。癌旁正常胰腺组织的GLI1 mRNA相对表达量为0.23～2.76，中位数为0.87；PTCH1 mRNA相对表达量为1.11～2.17，中位数为0.58。癌组织GLI1、PTCH1 mRNA的表达量均显著高于癌旁正常胰腺组织(P<0.05， 图1、2)。胰腺癌组织中GLIl mRNA的表达量与PTCH1 mRNA的表达量呈正相关(r=0.532，P<0.05)。

图1胰腺癌及癌旁正常胰腺组织中GLI1 mRNA的相对表达量

图2胰腺癌及癌旁正常胰腺组织中PTCH1 mRNA的相对表达量

二、GLI1、PTCH1 mRNA的表达与胰腺癌临床指标的相关性

GLI1 mRNA的表达量与胰腺癌的分化程度、有无淋巴结转移相关(r=0.312，P<0.05；r=0.298，P<0.05)，与肿瘤大小、有无远处转移无关。PTCH1 mRNA的表达量与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远处转移均无关(P>0.05，表1)。

表1胰腺癌GLI1、PTCH1 mRNA表达量与肿瘤临床指标的相关性分析

临床指标GLI1mRNA表达量r(P)PTCH1mRNA表达量r(P)肿瘤大小0.176(0.172)0.125(0.213)分化程度0.312(0.035)0.152(0.185)淋巴结转移0.298(0.041)-0.139(0.207)远处转移0.107(0.276)-0.064(0.324)

讨 论

胰腺癌恶性程度高，进展迅速，大多数患者就诊时已发生远处转移，失去手术切除的机会，预后极差。因此积极探索胰腺癌发生、发展的分子机制具有非常重要的意义。近年来研究发现，Hh信号通路与多种恶性肿瘤(包括胰腺癌)的发生及发展密切相关。哺乳动物Hh通路是由HH 配体、两个跨膜蛋白质受体PTCH和SMO所构成的复合物及下游的转录因子GLI蛋白等组成。在没有HH配体刺激时,PTCH抑制了SMO的活性。当HH与PTCH结合后，PTCH对SMO的抑制作用被解除，SMO进入胞内，激活下游转录因子GLI蛋白进入核内调控多种靶基因的表达。GLI1是该通路末端具有很强的激活功能的转录因子之一，可将细胞外的HH信号向胞核内传递，从而启动下游靶基因的转录。PTCH1既是该通路的跨膜蛋白质受体，又是该通路的靶基因之一。因此，PTCH1、GLI1是该通路的两个重要成员，是反映Hh通路活性程度的可靠指标[3]。

本研究采用实时定量PCR的方法检测胰腺癌及癌旁正常胰腺组织中GLI1、PTCH1 mRNA的表达，结果显示胰腺癌组织中GLI1、PTCH1 mRNA的表达量均显著高于癌旁正常胰腺组织，提示胰腺癌组织中存在着Hh通路的过度激活，这与前期研究结果一致[4-5]。本实验结果还显示，GLI1 mRNA的表达量与PTCH1 mRNA表达量呈正相关，推测这可能与PTCH1是Hh通路的下游靶基因有关，进一步证实GLI1、PTCH1可作为评估Hh通路活性程度的可靠指标。

Xuan等[6]应用免疫组化法检测乳腺癌组织中Hh通路成员，结果Ihh、GLI1,2,3的表达水平与其淋巴结转移显著相关，且Ihh、PTCH、GLI2与其临床分期相关，提示Hh通路在乳腺癌的淋巴路播散和进展中起重要作用。Gialmanidis等[7]检测了非小细胞肺癌中Hh通路成员的表达，发现淋巴结转移阳性组SMO的表达阳性率显著高于淋巴结转移阴性组，提示Hh通路与其淋巴结转移相关。本实验的相关性分析显示，GLI1 mRNA的表达量与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移显著相关，提示Hh通路可能参予了胰腺癌的侵袭及淋巴路的转移，与文献报道的结果一致。但有关该通路在促进肿瘤侵袭与淋巴转移的具体作用机制还有待于进一步深入研究。

[1] Hidalgo M,Maitra A.The hedgehog pathway and pancreatic cancer.N Engl J Med,2009,361:2094-2096.

[2] Katoh Y,Katoh M.Hedgehog target genes:mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation.Curr Mol Med,2009,9:873-886.

[3] Katoh Y,Katoh M.Hedgehog target genes: mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation.Curr Mol Med,2009,9:873-886.

[4] Shao J,Zhang L,Gao J,et al.Aberrant expression of PTCH (patched gene) and Smo (smoothened gene) in human pancreatic cancerous tissues and its association with hyperglycemia.Pancreas,2006,33:38-44.

[5] Gao J,Li Z,Chen Z,et al.Antisense Smo under the control of the PTCH1 promoter delivered by an adenoviral vector inhibits the growth of human pancreatic cancer.Gene Ther,2006,13:1587-1594.

[6] Xuan Y,Lin Z.Expression of Indian Hedgehog signaling molecules in breast cancer.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135:235-240.

[7] Gialmanidis IP,Bravou V,Amanetopoulou SG,et al.Overexpression of hedgehog pathway molecules and FOXM1 in non-small cell lung carcinomas.Lung Cancer,2009,66:64-74.

2010-03-03)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionofGLI1andPTCH1mRNAandytscorrelationwithclinicalparametersinpancreaticcancer

GUOJie-fang,GAOJun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,JINJing,MANXiao-hua,WUHong-yu.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：LIZhao-shen,Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in pancreatic cancer and study its clinical significance.MethodsReal-time fluorescence quantitative PCR (RFQ-PCR) was used to detect the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in 35 samples of pancreatic cancer tissues and 27 samples of adjacent normal pancreatic tissues, and the correlation of GLI1 and PTCH1 mRNA expression with clinical parameters was investigated.ResultsThe relative expression of GLI1 mRNA in pancreatic cancer tissues was 1.12～3.65 (median 1.19), the relative expression of TCH1 mRNA was 1.82～4.36 (median 2.36). The relative expression of GLI1 mRNA in adjacent normal pancreatic tissues was 0.23～2.76 (median 0.87), the relative expression of PTCH1 mRNA was 1.11～2.17 (median 0.58). Both the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in normal pancreatic tissues(P<0.05), and a positive correlation was found between GLI1 and PTCH1 mRNA expression levels (P<0.05).The expression of GLI1 mRNA was significantly correlated with the differentiation degree and lymph node metastasis of pancreatic cancer (P<0.05).ConclusionsGLI1 and PTCH1 may be involved in pancreatic carcinogenesis, and GLI1 may be related to invasion and lymph node metastasis of pancreatic cancer．

Pancreatic neoplasms； GLI1； PTCH1； Neoplasm invasiveness； Neoplasm metastasis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.016

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申，Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn