急性胰腺炎大鼠胰腺组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达及其意义

王培培 吴建胜 高道键 周蒙滔 方佩佩 贾国葆 孙学成 王旦

·论著·

急性胰腺炎大鼠胰腺组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达及其意义

王培培 吴建胜 高道键 周蒙滔 方佩佩 贾国葆 孙学成 王旦

目的检测急性胰腺炎(AP)大鼠胰腺组织中促凋亡基因Smac/DIABLO和凋亡抑制基因XIAP的mRNA表达，分析其与疾病严重程度的关系。方法54只SD大鼠按数字表法随机分成假手术组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组、急性坏死性胰腺炎(ANP)组。通过胰胆管逆行注射1%、3.5%脱氧胆酸钠方法分别制备AEP、ANP模型。收集制模后3、6、12 h胰腺标本，常规病理检查；TUNEL法检测细胞凋亡；实时定量PCR法检测Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达。结果胰腺病理改变表示模型制备成功。术后6 h假手术组、AEP组、ANP组胰腺腺泡细胞凋亡指数分别为0.67±0.82、6.62±0.78和4.70±0.82，各组间相差显著(P<0.05)。AEP组Smac/DIABLO mRNA的表达随时间延长而逐渐增加，ANP组则随时间延长而逐渐下降，以假手术组为参考，6 h时AEP组和ANP组的表达量分别为2.41±0.92和1.47±0.53，相差显著(P<0.05)。相反，AEP组XIAP mRNA的表达随时间延长逐渐下降，而ANP组表达逐渐增加，6 h时表达量分别为5.51±1.07和6.99±1.00，相差显著(P<0.05)。结论AP时胰腺组织Smac/DIABLO mRNA的表达与细胞凋亡指数一致，与病情严重程度相反，而XIAP mRNA的表达与病情严重程度一致。XIAP、Smac/DIABLO基因参与细胞凋亡的调节。

胰腺炎； 细胞凋亡； Smac/DIABLO； X-连锁凋亡抑制蛋白

细胞凋亡在急性胰腺炎(AP)的发病机制中起着一定的作用，腺泡细胞的凋亡率与疾病的严重程度呈负相关[1]。X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)通过抑制半胱氨酸天冬蛋白酶(caspase-3、-7、-9)而发挥抗凋亡作用。第二个线粒体源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活物/直接与凋亡抑制蛋白结合的低等电点蛋白(second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI，Smac/DIABLO)通过与XIAP的结合，拮抗XIAP对caspase的抑制，从而发挥促凋亡作用。本实验检测AP大鼠Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达,分析其与疾病严重程度的关系。

材料和方法

一、动物分组

健康SD雄性大鼠54只，体重200～250 g，由温州医学院实验动物中心提供。大鼠按数字表法随机分成假手术组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组、急性坏死性胰腺炎(ANP)组，每组18只。采用胰胆管逆行注射1%或3.5%脱氧胆酸钠(Sigma公司)0.1 ml/100 g体重的方法分别制备AEP和ANP模型；假手术组仅翻动胰腺数次。术后第3、6、12 h分批经下腔静脉取血，离心取上清液， -20℃保存；迅速取出胰腺组织，一部分置-80℃保存，一部分经4%多聚甲醛固定。

二、检测项目和方法

1．血淀粉酶测定：采用全自动生化分析仪检测。

2．胰腺组织病理形态学观察:按常规操作。

3．胰腺组织细胞凋亡检测：采用TUNEL法，根据TUNEL试剂盒(Roche公司)说明书操作。计算4个高倍视野凋亡细胞数占总细胞数的百分率，即为凋亡指数(apoptosis index，AI)。

4．胰腺组织Smac/DIABLO、XIAP mRNA检测：应用Trizol抽提组织总RNA，采用RT-PCR试剂盒(MBI)检测。Smae/DIABLO上游引物5′-GACACTGTGCGCCGTTCCTA-3′，下游引物5′-GAGGTGCTGTCCGTTACCAAAGA-3′；XIAP上游引物5′-TGAGGTTCTGATTGCAGATCTTGTG-3′，下游引物5′-CTTGTAGGCGCCTTAGCTGCTC-3′；内参GAPDH上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。引物由大连TaKaRa公司设计，上海生工生物工程公司合成。PCR反应：95℃ 10 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，循环40次。反应完成后再于95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s得融解曲线。根据Livak和Schmittgen[2]设计的阈值法测定mRNA表达量。目的基因表达量=2-△△Ct,△△Ct=实验组(Ct目的基因-Ct管家基因)-对照组(Ct目的基因-Ct管家基因)。实验重复3次，取其均数。

三、统计学方法

结 果

一、血清淀粉酶活性变化

AEP组和ANP组血清淀粉酶活性随时间延长逐步升高；假手术组、AEP组和ANP组间相差显著(表1)。

二、胰腺组织病理学改变

假手术组胰腺未见明显异常；AEP组胰腺间质充血、水肿、炎性细胞浸润，并随时间延长而略加重；ANP组胰腺间质水肿，出血明显，12 h时严重出血、坏死，大量炎细胞浸润。

三、胰腺组织细胞凋亡的变化

假手术组偶见凋亡细胞；AEP组和ANP组AI随时间延长而增高，均较假手术组显著增加(P<0.05)，且AEP组增加更显著(P<0.01，表1,图1)。

四、胰腺组织Smac/DIABLO、XIAP mRNA表达的变化

以假手术组为参照，AEP组Smac/DIABLO mRNA的表达随时间延长而逐渐增加，ANP组则随时间延长而逐渐下降(P<0.05，表2)；相反，AEP组XIAP mRNA的表达随时间延长逐渐下降，而ANP组表达逐渐增加(P<0.05，表2)。

表1 各组血淀粉酶活性及细胞凋亡指数变化

注：与假手术组比较，aP<0.05，bP<0.01；与AEP组比较，cP<0.05

图1假手术组(a)、AEP组(b)、ANP组(c)胰腺组织细胞凋亡(TUNEL ×400)

表2 各组Smac/DIABLO、XIAP mRNA 的表达

注：与AEP组比较，aP<0.05

讨 论

目前认为，AP的严重程度与腺泡细胞凋亡、坏死的严重程度及两者的平衡程度密切相关。细胞凋

亡贯穿于疾病的整个过程[3]，并与AP病情的严重程度呈负相关[1]。本实验结果显示，AEP组和ANP组胰腺组织损伤随时间延长逐渐加重，但AEP组随时间延长细胞凋亡数增多，ANP组随着时间延长细胞凋亡数较AEP组相对减少，表明细胞凋亡可能是保护细胞免于坏死、减轻细胞坏死引起的炎症反应，与Kaiser等[4]的报道一致。

Smac/DIABLO是目前发现的唯一直接抑制XIAP的负性调节因子。Smac/DIABLO具有双重功效，它既能消除XIAP对caspase的抑制从而激活caspase酶原，又能增强成熟caspase的活性[5]。在细胞受到各种凋亡刺激时，Smac/DIABLO与细胞色素C共同释放入细胞质，通过逆转XIAP的作用实现其促凋亡作用，但不引起XIAP的快速降解[6]。

本实验结果显示，随时间延长，AEP组胰腺Smac/DIABLO mRNA表达与细胞凋亡均逐渐增加，XIAP mRNA表达逐渐下降，而ANP组胰腺XIAP mRNA表达逐渐增加， Smac/DIABLO mRNA表达逐渐下降，凋亡细胞较AEP组减少。推测AEP大鼠可能通过高表达Smac/DIABLO抑制XIAP，从而促进细胞凋亡，而ANP大鼠可能通过高表达XIAP抑制caspase的激活，抑制细胞凋亡，促使腺泡细胞经坏死方式死亡，从而加重AP的进展。

[1] Takeyama Y.Significance of apoptotic cell deat h in systemic complications with sever acute pancreatitis.J Gastroenterol,2005,40:1-10.

[2] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.Methods,2001,25:402-408.

[3] 许雪峰,王单松,楼文晖,等.胰腺细胞凋亡参与重症急性胰腺炎病理反应全过程.中国临床医学,2005,12:1036-1037.

[4] Kaiser AM,Saluja AK,Sengupta A,et al.Relationship between severity,necrosis,and apoptosis in five models of experimental acute pancreatitis.Am J Physiol,1995,269:C1295-1304.

[5] Fuentes-Prior P,Salvesen GS.The protein structures that shape caspase activity,specificity,activation and inhibition.Biochem J,2004,384:201-232.

[6] Yang QH,Du C.Smac/DIABLO selectively reduces the levels of c-IAP1 and c-IAP2 but not that of XIAP and livin in HeLa cells. J Biol Chem,2004,279:16963-16970.

2009-09-07)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionandsignificanceofSmac/DIABLO,XIAPmRNAinratswithacutepancreatitis

WANGPei-pei,WUJian-sheng,GAODao-jian,ZHOUMeng-tao,FANGPei-pei,JIAGuo-bao,SUNXue-cheng,WANGDan.

DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China

Correspondingauther:WUJian-sheng,Email:wzwujd@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of Smac/DIABLO, XIAP mRNA in acute pancreatitis (AP) and the relationship with the severity in rats.MethodsFifty-four SD rats were randomly divided into three groups: sham-operation (SO) group, acute edematous pancreatitis (AEP) group and acute necrotizing pancreatitis (ANP) group. The models of AEP and ANP were induced by retrograde injection of 1% and 3.5% sodium deoxycholate into the pancreaticobiliary duct respectively. The specimens of pancreatic tissue at 3 h, 6 h, 12 h were collected, pathological changes of the pancreas were observed, apoptosis in pancreas were detected by TUNEL method and the expression of Smac/DIABLO, XIAP mRNA were analyzed by real-time PCR.ResultsPathological changes of the pancreas confirmed the establishment of AEP and ANP. Apoptosis indexes in SO group, AEP group and ANP group were 0.67±0.82, 6.62±0.78 and 4.70±0.82, and the differences were significant (P<0.05). The expression of Smac/DIABLO mRNA of AEP group increased with time, while the expression of ANP group decreased with time. Compared with SO group, Smac/DIABLO mRNA expressions at 6 h in AEP and ANP group were 2.41±0.92 and 1.47±0.53, and the differences were significant (P<0.05). By contrast, the expressions of XIAP mRNA in AEP group decreased with time,while the expressions in ANP group increased with time. The expressionsof XIAP mRNA at 6 h in AEP and ANP group were 5.51±1.07 and 6.99±1.00, and the differences were significant (P<0.05).ConclusionsIn acute pancreatitis, the expression of Smac/DIABLO mRNA was consistent with the apoptosis of pancreatic acinar cells, but not consistent with the severity of pancreatitis. The expression of XIAP mRNA was consistent with the severity of pancreatitis. Smac/DIABLO, XIAP mRNA is associated with regulation of apoptosis.

Pancreatitis; Apoptosis; Smac/DIABLO; XIAP

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.010

浙江省自然科学基金(Y2080387)

325000 温州，温州医学院附属第一医院消化内科

吴建胜，Email:wzwujs@163.com