沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响

范钰 吴莺 徐军 钟锡明

·论著·

沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响

范钰 吴莺 徐军 钟锡明

目的探讨TDGF-1基因沉默对胰腺癌细胞株PANC1侵袭力的影响。方法设计并合成3个(S1、S2、S3)靶向TDGF-1 基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，筛选出沉默效果最好的siRNA。以该siRNA的不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)转染PANC1细胞，并设对照组和脂质体组。采用实时定量PCR和Western blotting检测TDGF-1 mRNA和蛋白表达，以软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力，并将转染48 h的细胞接种裸鼠，观察癌细胞的体内侵袭。结果siRNA转染组细胞的TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性下降，且较脂质体组明显降低(P值均<0.01)。对照组细胞集落形成数和穿膜细胞数分别为19.8±2.2和49.8±2.6；siRNA组呈浓度依赖性明显减少，12.5 nmol/L转染组分别为5.6±1.2和8.1±1.1。对照组、脂质体组和12.5 nmol/L转染组接种4周后裸鼠种植瘤体积分别为(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3。对照组和脂质体组种植瘤侵犯周围肌层组织，转染细胞组未见侵犯。结论采用RNA干扰技术沉默PANC1细胞的TDGF-1基因表达可抑制癌细胞的侵袭力。

胰腺肿瘤； 畸胎瘤衍生生长因子-1； 肿瘤侵袭； 小分子干扰RNA

畸胎瘤衍生生长因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)是一种自分泌型肿瘤生长因子，是表皮生长因子家族重要成员之一[1]。它定位在人类染色体3p21.3[1]，编码cripto蛋白。研究发现，TDGF-1基因在乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、阴茎癌、膀胱癌及前列腺癌等肿瘤中均过度表达，并与肿瘤浸润有关，而在正常组织中不表达或低表达[2]。为此，本实验应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞TDGF-1 基因的表达，观察其对癌细胞侵袭力的影响。

材料和方法

一、细胞培养及转染

胰腺癌细胞株PANC1(ATCC公司)常规培养传代。转染前1 d，将1×105对数期生长细胞接种于24孔培养板，每孔1 ml，次日应用Oligofectamine进行转染。细胞分对照组、脂质体组、siRNA-C组和siRNA组。设计3个siRNA，S1：正义链5′-UUCGGCCUCGGUCUUCCCATT-3′，反义链5′-UGGGAAGACCGAGGCCGAATT-3′，靶点175～195；S2：正义链5′-GGCUGCUGCUACAAUGUCCTT-3′，反义链5′-GGACAUUGUAGCAGCAGCCTT-3′，靶点630～650；S3：正义链5′-GAAUGAAGCCUCCUUAGAATT-3′，反义链5′-UUCUAAGGAGGCUUCAUUCTT-3′，靶点1544～1564。阴性对照siRNA-C：正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTDTD-3′，反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATDTDT-3′。所有siRNA均由美国Dharmacon公司合成。对照组未经任何处理；脂质体组用脂质体处理；siRNA-C组转染siRNA-C； siRNA组分别转染3个siRNA。选其中干扰效果最佳的siRNA，再用不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)转染细胞。每组设3个复孔。转染后分别培养24、48、72 h，收集细胞。

二、细胞TDGF-1 mRNA检测

采用荧光实时定量PCR检测。TDGF-1上游引物5′-CAATTCGGCCTCGGTCTTC-3′，下游引物5′-TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT-3′；FAM探针：5′-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′-TAMRA。以GAPDH为内参。PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s 、52℃ 45 s、72℃ 45 s，35 个循环，72℃再延伸7 min。结果计算参照文献[7]， cDNATDGF-1=cDNAGAPDH×2△CT(△CT=CTGAPDH-CTTDGF-1)。

三、细胞TDGF-1蛋白检测

采用Western blotting法。以目的条带与β-actin灰度值的百分值表示蛋白表达量。

四、软琼脂集落形成试验

参照文献[3]的方法计数集落形成数。

五、体外侵袭试验

参照文献[4]方法，采用Boyden小室模型。400高倍镜下计算5个视野内穿膜细胞数，取均值。

六、裸鼠体内侵袭试验

Balb/c裸鼠，15只，雌性，4周龄，体重14～18 g，购自中国科学院上海生物化学研究所，SPF级。分为对照组、脂质体组和siRNA组，各5只。对照组接种未转染的胰腺癌细胞；脂质体组接种脂质体处理的癌细胞；siRNA组接种12.5 nmol/L siRNA转染48 h后的癌细胞。裸鼠皮下接种细胞数为5×105个。4周后断颈处死裸鼠，观察肿瘤在体内的浸润和转移，并常规行病理检查。

七、统计学方法

结 果

一、靶向TDGF-1 siRNA的筛选

以对照组细胞TDGF-1 mRNA 表达量为1，S1、S2、S3 siRNA转染细胞的TDGF-1 mRNA表达量分别为(9.2±0.3)%、(50.0±0.5)%和(11.5±0.8)%，S1的siRNA抑制效果最好，故以下实验均应用S1的siRNA转染的细胞。

二、转染细胞TDGF-1mRNA和蛋白表达的变化

与脂质体组比较，siRNA组TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平均呈浓度和时间依赖性明显下降(P值均<0.01，表1)。

三、细胞集落形成数的变化

对照组、脂质体组、siRNA-C组及siRNA 3.125、6.25、12.5 nmol/L组PANC1细胞在软琼脂培养基上的集落形成数分别为19.8±2.2、19.6±2.2、19.5±1.9、12.5±1.9、9.9±1.8、5.6±1.2，siRNA转染的细胞集落生长数呈浓度依赖性减少(P<0.05)。

表1 转染细胞TDGF-1 基因mRNA和蛋白表达的变化

注：与脂质体组比较，aP<0.01

四、细胞侵袭力的变化

对照组、脂质体组、siRNA-C组及siRNA 3.125、6.25、12.5 nmol/L组穿过滤膜的细胞数分别为49.8±2.6、49.6±2.5、49.5±1.8、31.8±1.9、16.9±2.1、8.1±1.1，siRNA组细胞的侵袭力呈浓度依赖性下降(P<0.05)。

五、裸鼠移植瘤

对照组、脂质体组和siRNA(12.5 nmol/L)转染组裸鼠均在接种后第4天左右开始形成肿瘤，接种后4周瘤体积分别为(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3。3组裸鼠均未见转移灶，但对照组和脂质体组种植瘤细胞侵犯周围肌层组织(图1a)及血管(图1b)，而siRNA转染组未见侵犯。

图1 癌细胞侵袭横纹肌(a)及血管(b)(HE ×200)

RNA干扰(RNAi)能够使基因的mRNA转录被相应的双链RNA分子敲除，关闭基因表达的效果远强于应用正义和反义RNA[5]。siRNA是指RNAi干扰过程中细胞内产生的长约21～25核苷酸的小双链RNA，是产生RNAi的中间效应分子。目前人工可合成siRNA，具有明显的抑制相应基因mRNA转录的效果[6]。

本实验采用化学方法合成靶向TDGF-1基因的siRNA，转染胰腺癌PANC1细胞后，细胞TDGF-1 mRNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性明显下降。说明该siRNA能有效沉默基因的表达。

肿瘤细胞在软琼脂上培养后形成集落的多少与细胞恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。本实验结果显示，siRNA转染细胞形成的集落数呈浓度依赖性减少，提示细胞的侵袭能力被明显抑制。

Boyden小室模型也是广泛应用于检测癌细胞侵袭试验的经典模型。本实验结果显示，siRNA转染组穿膜细胞数呈浓度依赖性明显减少，且裸鼠种植瘤的癌细胞未侵犯种植瘤周围组织，提示抑制TDGF-1基因表达可抑制胰腺癌细胞的体外、体内的侵袭能力。

[1] Ciccodicola A,Dono R,Obici S,et al.Molecular characterization of a gene of the ‘EGF family’ expressed in undifferentiated human NTERA2 teratocarcinoma cells.EMBO J,1989,8:1987-1991.

[2] Salomon DS,Bianco C,De Santis M.Cripto:a novel epidermal growth factor (EGF)-related peptide in mammary gland development and neoplasia. Bioessays,1999,21:61-70.

[3] 范钰，郑树，赵刚.青蒿琥酯对乳腺癌MCF-7细胞抗失巢凋亡的影响.中国病理生理杂志，2006，22:571-575.

[4] Fan Y,Zhang YL,Wu Y,et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells.World J Gastroenterol,2008,14:428-434.

[5] Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature,1998,391:806-811.

[6] Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature,2001,411:494-498.

2009-05-04)

(本文编辑：屠振兴)

Effectsofteratocarcinoma-derivedgrowthfactor-1oninvasionofhumanpancreaticcancercelllinePANC1

FANYu,WUYing,XUJun,ZHONGXi-ming.

CancerInstitute,AffiliatedPeople′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

Correspondingauthor:FANYu,Email:yuf36@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of the silence of teratocarcinoma-derived growth factor-1(TDGF-1) gene on invasion of human pancreatic cancer cell.MethodsThree small interfering RNA (siRNA ) targeting for TDGF-1 genes (S1, S2, S3) were designed and established, then the gene with the best silencing effects was screened. Human pancreatic cancer cell line PANC1 were transfected by siRNA with different concentrations (3.125, 6.25, 12.5 nmol/L), the cells without transfection, and simply treated with liposomes were controls.The expressions of mRNA and protein of TDGF-1 were determined by real time PCR and Western blot assay, respectively. The anchorage-independent growth was examined by clon formation in soft agar, and invasion ability was evaluated by boyden chamber model. PANC1 cells with transfection for 48h were injected into the nude mice to evaluate the invasion abilityinvivo.ResultsThe expressions of TDGF-1 mRNA and protein of cells transfected by siRNA were decreased in a dose- and time-dependent manner, which were significantly lower than those in liposomes group. Number of colony formation and transmembrane cell were 19.8±2.2 and 49.8±2.6 in the control group, and 5.6±1.2 and 8.1±1.1 in the 12.5 nmol/L transfection group. The volumes of tumor 4 weeks after transplation in the control group, liposomes group and the 12.5 nmol/L transfection group were (2.228±0.016) cm3, (2.186±0.028) cm3and (0.728±0.023) cm3.ConclusionsTDGF-1 gene silence could inhibit invasion ability of human pancreatic cancer cell PANC1.

Pancreatic neoplasms； Teratocarcinoma-derived growth factor-1； Neoplasm invasiveness； Small interfering RNA

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.017

中国博士后科学基金(2003033547)

212002 镇江，江苏大学附属人民医院肿瘤研究所

范钰，Email:yuf36@sina.com