黄芩苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

胡秀梅

(镇江市第一人民医院药剂科, 镇江 212000)

黄芩苷(baicalin)是唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis georgi)中提取的单体化合物,属葡萄糖醛酸苷类,水解后产生黄芩素和葡萄糖醛酸。黄芩苷除了具有传统意义上的清热解毒、抑菌抗炎、利胆、降压、利尿、抗变态反应等生物活性外,近年来还发现黄芩苷具有抗肺炎衣原体所致的动脉粥样硬化、保护心肌缺血再灌注损伤、抗肿瘤和抗 HIV等多方面作用[1-4]。本文采用大脑中动脉栓塞(MCAO)模型考察了黄芩苷对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用,并初步探讨了其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器 黄芩苷,南京中医药大学中药化学教研室提供,纯度＞90%;尼莫地平注射液,山东新华制药股份有限公司生产,批号:0708006;水合氯醛,中国医药(集团)上海化学试剂公司,批号:20070610;氯化硝基四氮唑蓝(NBT),上海前进化学试剂厂,批号 20060506;一氧化氮(NO)试剂盒,一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒,丙二醛(MDA)测定试剂盒,超氧化物歧化酶(SOD)测试盒,均为南京建成生物工程研究所生产。GS-15R型台式高速冷冻离心机(美国 Beckman公司);Sartorius电子天平(德国 Sartorius公司);T25basic匀浆机(德国 IKA公司)。

1.2 动物分组及模型制备 清洁级雄性 SD大鼠72只,体重 240-310 g,购自南京医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(苏)2008-0004。实验条件下适应性饲养 1周后,随机分为6组,每组 12只,分别是假手术组,脑缺血再灌注模型组,黄芩苷组[15,45,135 mg/(kg· d)],尼莫地平组[5 mg/(kg· d)]。各组动物连续尾静脉注射给药 3 d后,并于缺血 3 h再灌注即刻重复给药一次,假手术组和模型组于相同时间给予相应体积的生理盐水,分别于再灌注 30 min,4 h,24 h后检测相应指标。

以长50 mm、直径 0.24 mm、顶端烫制成光滑球状的尼龙线作为栓子,采用改进的Longa的方法[5]制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。缺血 3 h后再灌注,再灌注时轻拉尼龙线,使尼龙线拔出颅外。假手术组只进行麻醉和血管分离术,不结扎血管及导入尼龙线。以上过程均在室温恒定(24-25℃)情况下进行,以利于评价脑缺血情况。

1.3 大鼠实验性脑缺血行为评分法 参考 Bederson等[6]的方法,分别在动物缺血再灌注 4 h和24 h时对各组动物的行为缺陷进行神经功能评分,评分标准如下:0分,提尾悬空时,动物的两前肢均伸向地板方向且无其他行为缺陷;1分,提尾悬空时,动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁;2分,将动物置于光滑平面上,推手术侧肩向对侧移动时阻力降低;3分,动物自由行走时,向手术对侧环转或转圈。

1.4 NBT染色测量脑梗死率 大鼠脑缺血再灌注24 h后断头取脑,去除嗅球、小脑和低位脑干,取左侧(即缺血区)大脑半球沿冠状面切成 5片,进行NBT染色,置 37℃温育 15 min后,正常组织呈蓝色,梗死组织呈白色。小心挖取并称重未染色的梗死脑组织,并计算梗死脑组织质量占对侧大脑质量的百分比,作为脑梗死率[7]。

1.5 脑含水量的测定 大鼠脑缺血再灌注 24 h后处死,取出大脑称湿重后将脑组织置于 115℃电热干燥箱中烘至恒重,称干重,按下列公式计算脑含水量及脑指数[8]:含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%;脑指数=(脑湿重 /体重)×100。

1.6 脑组织中 NO、NOS、MDA、SOD含量测定 脑组织匀浆的制备[9]:大鼠于缺血再灌注 30 min后断头快速取脑,将左侧脑组织用滤纸擦去表面残血,用分析天平称取 0.5 g,按 1∶9加入生理盐水,用玻璃匀浆器研磨,制成 10%脑组织匀浆,4℃ 4 000 r/min离心 10 min,取上清液,-20℃保存待测生化指标。

采用硝酸还原酶法测定脑组织中 NO含量,采用 NOS检测试剂盒测定 NOS的活性,采用硫代巴比妥酸显色法测定脑组织 MDA含量,SOD活力检测采用黄嘌呤氧化法,以上所有操作均按试剂盒操作程序进行。

2 结果

2.1 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠的行为学评分的影响 脑缺血再灌注 4 h和24 h后,所有试验动物均出现了不同程度的行为障碍,模型组行为学评分分别是 2.75±0.41和2.08±0.52。其中 4 h后,黄芩苷各剂量组大鼠的行为学评分与模型组相近,差异无统计学意义;在 24 h后,黄芩苷各剂量组动物的行为学评分均呈下降趋势,中、高剂量组与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),结果见表1。

2.2 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑梗死率的影响大鼠缺血再灌注后脑组织出现明显梗死,梗死率达(22.25±6.42)%;黄芩苷低、中、高各剂量组大鼠脑梗死率出现了明显降低,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),结果见表1。

2.3 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑含水量和脑指数的影响 假手术组大鼠脑含水量和脑指数分别为(72.58±9.61)%和0.42±0.13,脑缺血再灌注模型组大鼠脑含水量和脑指数分别为(79.54±8.95)%和0.51±0.16,脑部出现水肿特征,与假手术组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。黄芩苷中、高剂量组对于水肿特征具有明显改善作用,与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),结果见表1。

表1 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠行为学评分、脑梗死率、脑含水量和脑指数的影响 (±s,n=12)Tab 1 Effect of baicalin on behavior,cerebral infarction,water content of brain tissues and cerebral index in ischemiareperfusion rats (±s,n=12)

表1 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠行为学评分、脑梗死率、脑含水量和脑指数的影响 (±s,n=12)Tab 1 Effect of baicalin on behavior,cerebral infarction,water content of brain tissues and cerebral index in ischemiareperfusion rats (±s,n=12)

与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与假手术组比较,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

?

2.4 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织 NO、NOS、MDA、SOD的影响 大鼠脑缺血 3 h再灌注 30 min后引起脑组织 NO和NOS含量的升高,黄芩苷各个剂量组均能显著降低脑组织内 NO的含量(P＜0.05,P＜0.01),NOS活性亦呈现下降趋势,黄芩苷高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。大鼠脑缺血再灌注 30 min后MDA含量明显升高,SOD含量明显下降,黄芩苷能降低 MDA的含量,并升高 SOD的含量,中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),结果见表2。

表2 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织 NO、NOS、MDA、SOD的影响 (±s,n=12)Tab 2 Effect of baicalin on NO,NOS,MDA,SOD contents of brain tissues in ischemia-reperfusion rats (±s,n=12)

表2 黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠脑组织 NO、NOS、MDA、SOD的影响 (±s,n=12)Tab 2 Effect of baicalin on NO,NOS,MDA,SOD contents of brain tissues in ischemia-reperfusion rats (±s,n=12)

与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与假手术组比较,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01

45 mg/(kg· d) 22.46±5.82** 3.26±1.08 42.32±7.88* 379.40±64.55*135 mg/(kg· d) 17.76±4.91** 3.05±0.83* 33.79±6.47** 449.82±80.76**

3 讨论

缺血性脑血管疾病的发病率、致残率和病死率均较高,一般以局灶性脑缺血为主,其中大脑中动脉栓塞造成的脑梗死最为多见。溶栓疗法可使血管再通恢复血供,但同时亦可导致更为严重的脑缺血再灌注损伤,寻找具有能减轻脑缺血再灌注损伤的药物意义重大。黄芩苷是中药黄芩的有效成分之一,相对分子质量 446,可通过血脑屏障。本实验研究发现,黄芩苷对脑缺血再灌注大鼠的神经行为学具有明显的改善作用,还能降低脑缺血再灌注大鼠的脑梗死率和脑含水量,对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用,并具有剂量效应关系。尼莫地平因其对脑缺血再灌注损伤具有确切的保护作用,在实验研究中常被用来做阳性对照药物,本实验也发现,尼莫地平5 mg/(kg·d)的剂量能显著改善脑缺血再灌注大鼠的神经行为学评分,降低脑梗死率和脑含水量,与黄芩苷中高剂量组作用相似。

缺血再灌注损伤发病机制中,自由基的作用和细胞内钙超载是其发病学的两个重要环节。再灌注损伤后机体通过多种途径产生的自由基对细胞的各种成分(膜磷脂、蛋白、核酸)造成损伤。姜德华等[10]研究发现,大鼠脑缺血 30 min NO含量和NOS活性即显著升高,缺血 3 h两者下降;再灌注 30 min NO和NOS又再次升高,说明 NO和NOS参与了脑缺血再灌注的发病机制。本实验也发现在脑缺血 3 h再灌注 30 min后脑组织NO和NOS的含量显著升高,黄芩苷能明显降低脑组织内 NO的含量和NOS的活性,从而减轻 NO的神经细胞毒性。同时,黄芩苷能降低缺血再灌注大鼠脑组织 MDA的含量,并增加 SOD的活性,从而抑制自由基导致的脂质过氧化作用,减轻自由基对脑组织的损伤,发挥一定的脑保护作用。黄芩苷的脑保护作用可能与其在脑缺血再灌注早期具有抗氧化作用有关,但其他作用途径和详尽作用机制还有待进一步研究。

[1] 吴伟,黄衍寿,刘煜德,等.肺炎衣原体对动脉硬化斑块面积的影响及黄芩苷的干预作用[J].广州中医药大学学报,2006,23(4):322-325.

[2] 欧阳昌汉,吴基良,陈金和.黄芩苷对心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的影响[J].中药药理与临床,2005,21(5):14-16.

[3] 李宏捷,谢文利,朱江.黄芩苷的抗肿瘤作用及对肿瘤细胞端粒酶的影响[J].江苏医药,2008,34(9):931-933.

[4] Wu JA,Attele AS,Zhang L,etal.Anti-HIV activity of medicinal herbs:Usage and potential development[J].Am J Chin Med,2001,29(1):69-81.

[5] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[6] Bederson JB,Pitis LH,Tsun M,etal.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[7] Wu HP,Zhu XG.The protective effect of total glucosides of paeony on cerebral infraction in rats[J].Chin Pharmacol Bull,2001,17(2):223-225.

[8] 李东亮,赵红岗.孕酮对脑缺血再灌注大鼠纹状体水、钠、钾及钙含量的影响[J].中国病理生理杂志,2001,17(10):1012-1015.

[9] Oyanagai Y.Revaluation of assay methodsand establish of kit for superoxide dismutase activity[J].Anal Biochem,1984,142:290-294.

[10] 姜德华,金男革,玄汉石,等.大鼠急性局灶性脑缺血再灌注脑组织 NO含量和NOS活性的变化[J].临床神经病学杂志,2000,13(4):201-203.