我国分离的大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因检测分析*

王 涛,刘丽云,王 娉,熊衍文,白雪梅,叶长芸,徐建国

2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206

肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7是引起人类感染性腹泻的病原菌,由于可导致患者出血性肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(H US)、血栓性血小板减少性紫癜(T TP)等病死率高的疾病〔1〕,因而已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。大肠埃希菌O157∶H7主要依靠它产生的志贺毒素、溶血素和对上皮细胞的粘附素引起人体的损害。其中志贺毒素(Shiga toxin,Stx)包括志贺毒素1和志贺毒素2,是引起人类溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜的主要毒力因子,分别由st x1、stx2基因编码。而由hlyA和eaeA基因编码的溶血素和对上皮细胞的粘附素也是重要的致病因子。为了解我国部分省区大肠埃希菌O157∶H7的毒力基因携带特点,采用PCR方法对1992-2006年我国部分省区分离到的大肠埃希菌O157∶H7菌株的特异基因及毒力基因进行检测分析,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验菌株分离自中国江苏、安徽、河南、河北、山东、宁夏、天津、云南八个不同地区的病人,牛、羊等家畜家禽以及食品和饮用水,并经本室系统生化鉴定,O157及H7血清复核后保存。阳性对照菌株EDL933及阴性对照菌株MG1655均由本室保存。DNA提取试剂盒由北京天根公司提供。PCR主要试剂及Taq DNA聚合酶购自T aKaRa公司。PCR仪为Labcycler(SensoQuest)。凝胶成像系统为Gel Doc XR(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 制备DNA模板 按试剂盒方法提取实验菌株DNA模板,置-20℃保存。

1.2.2 PCR引物设计 引物设计参照文献〔2-6〕,并略作修改,由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列及PCR扩增条件见表1。

1.2.3 PCR检测 以O157∶H7标准菌株EDL933和MG1655菌株作为阳性及阴性对照,按照常规PCR方法,分别用6对引物扩增相应DNA片段,取5μ L扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,经溴化乙锭染色后凝胶成像系统观察并记录结果。PCR扩增条件优化后,以6对引物用相同的条件对345株菌进行检测。

1.2.4 资料统计与分析 根据实验结果,统计各毒力基因携带率,并用SPSS 11.5软件对人及不同动物之间毒力基因的携带率差异进行χ2检验,以P＜0.05为显著性差异。

2 结 果

2.1 引物特异性检测 以EDL933为模板,加入相应单一引物进行扩增,均可扩增出相应目标条带,而阴性对照MG1655及空白对照未见扩增(图1)。

2.2 O157∶H7菌株检出情况 经O157(rfbEO157)及H7(f liCH7)抗原特异基因检测末明,我国1992-2006年收集的345株O157、H7抗原阳性的菌株rf bEO157及f liCH7特异基因均为阳性。

2.3 O157∶H7菌株的毒力基因检测 对收集的O157∶H7菌株四种毒力基因检测结果显示,st x2基因的阳性率为91.9%,但只有少数菌株(13.3%)携带st x1基因。携带有stx1基因的菌株同时也携带有st x2基因的占97.9%,且只分布在1992年(4株)、1999年(15株)、2001年(19株)、2002年(6株)及2005年(1株)分离的菌株中。eaeA和hly A基因的阳性率分别为99.4%和99.1%。检测菌株中毒力基因型以eaeA+hlyA+stx2为主(见表2)。进一步分析发现,stx2阳性的317株菌中,eaeA均为阳性,hly A基因阴性的菌株只有2株;而stx1或stx2阴性的27株菌中,eaeA均为阳性,hlyA阳性的为26株。

2.4 菌株来源及毒力基因分析 本研究中的345株菌中,来源于人的菌株25株中,stx1的阳性率为32.0%,stx2阳性率为92.0%。其余大多数来源于动物宿主。来源于羊的菌株中92.6%携带st x2基因,仅有1.4%携带stx1基因,来源于牛、猪、鸡的菌株st x2、stx1基因阳性率分别为91.7%、10.0%,87.2%、6.4%,88.2%、8.8%(图 2)。人及不同动物之间st x2基因的携带率差异无统计学意义(χ2=1.980,P=0.739)。

3 讨 论

1999年我国江苏省徐州市及邻近的安徽省发生了一次大肠埃希菌O157∶H7感染暴发,导致177人死亡。2000年在河南省又发生了一次暴发,导致

28人死亡〔7〕。本次实验中的菌株主要分离自1999-2000年。近年来虽然没有出现大的O157∶H7感染暴发,但从中国疾病预防控制中心2006-2008年的传染病监测报告看,每年均能从人或动物中分离出产毒性大肠埃希菌O157∶H7菌株。我们对345株大肠埃希菌O157∶H7的特异基因检测表明,O157及H7抗原阳性的菌株rfbEO157及f liCH7特异基因均为阳性。因此在实际筛查工作中,可以通过简单快速的基因检测,来取代繁琐耗时的血清学试验。

表1 PCR引物序列、反应条件及扩增片段大小Table 1 The sequence of primers for the PCR,annealing temperature and the sizes amplified

表2 345株O157∶H7菌株来源及毒力基因检测结果Table 2 The virulent genes profiles of 345 O157∶H7 isolates

大肠埃希菌O157∶H7可携带不同型别的stx基因,stx基因的存在及具有活性的Stx是影响疾病发生、发展及转归的重要因素,Stx2能引起更加严重的症状和组织病理学改变,与严重疾病的关系较Stx1更为密切〔7-8〕。对345株菌株的毒力基因检测表明我国O157∶H7菌株主要为eaeA+hly A+stx2毒力基因型,而stx1单独阳性的菌株只有1株。从2006-2008年中国疾病预防控制中心的监测报告看,近年分离的产毒性O157∶H7菌株也只有st x2基因阳性,而没有stx1阳性的菌株。部分人和动物来源的菌株只检测到eaeA和hlyA毒力基因,而stx1或stx2基因均阴性,这类菌株在致病性和流行病学方面的意义尚不清楚。

毒力基因的存在是病原菌导致机体感染的重要条件。对动物来源的大肠埃希菌O157∶H7毒力基因分析表明,携带毒力基因的菌株广泛存在于羊、牛等动物宿主中。中国大肠埃希菌O157∶H7的感染多发在农村,由于农村地区羊、牛等家畜家禽常见且多为散养,认为羊、牛等家畜家禽是大肠埃希菌O157∶H7感染的重要传染源,动物宿主在大肠埃希菌O157∶H7感染的暴发流行中具有重要作用。因此,掌握动物宿主的带菌情况在预防和控制大肠埃希菌 O157∶H7感染流行的工作中具有重要意义。

〔1〕Paton JC and Pton AW.Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producingEscherichia coliinfections〔J〕.Clin Microbiol Rev,1998,11(3)：450-479.

〔2〕Paton AW and Paton JC.Detection and characterization of Shiga toxigenicEscherichia coliby using multiplex PCR assays forstx1,stx2,eaeA,EnterohemorrhagicE.coli hlyA,r fbO111,andrfbO157〔J〕.J Clin Microbiol,1998,36(2)：598-602.

〔3〕Johnson JR,Stell A.PCR for specific detection of H7 flagellar variant off liCamong ex traintestinal pathogenicEscherichia coli〔J〕.J Clin Microbiol,2001,39(10)：3712-3717.

〔4〕Zhang W,Bielaszewska M,Kuczius T,et al.Identification,chateracterization,and distribution of a Shiga toxin 1 gene variant(stx1c)inEscherichia colistrains isolated from humans〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40(4)：1441-1446.

〔5〕Schmidt H,Montag M,Bockemuhl J,et al.Shiga-like toxin II-related cytotoxins inCitrobacter freundiistrains from humans and beef samples〔J〕.Infect Immun,1993,61(2)：534-543.

〔6〕Wang G,Clark CG,Rodgers FG.Detection inEscherichia coliof the genes encoding the major virulence factors,the genes defining the O157∶H7 serotype,and components of the ty pe 2 Shiga toxin family by multiplex PCR〔J〕.J Clin Microbiol,2002,40(10)：3613-3619.

〔7〕Zheng H,Jing H,Wang H,et al.st x2vhais the dominant genotype of Shiga toxin-producingEscherichia coliO157∶H7 isolated from patients and domestic animals in three regions of China〔J〕.Microbio Immunol,2005,49(12)：1019-1025.

〔8〕罗霞,叶长芸,李芳,等.大肠埃希菌O157∶H7携带stx2：：IS1203v基因研究〔J〕.中华流行病学杂志,2007,28(11)：1119-1122.