嗜肺军团菌lvgA基因分析及实时荧光定量RT-PCR对军团菌的检测*

单小云,胡 野,应延风,屠平光

2.金华职业技术学院人畜共患病研究所,金华 321007

军团菌是一种兼性胞内寄生的人畜共患病病原体,广泛存在于天然淡水和人工水域等多种水体环境中。由军团菌感染引起的军团菌病是一种以肺炎为主要临床表现的急性细菌性传染病,病程进展快,死亡率高〔1-2〕。研究表明,军团菌有48种70个血清型〔3〕,但90%以上的军团菌肺炎均由嗜肺军团菌感染引起〔4-5〕。随着城市化进程加快,大型建筑增多,城市人口居住密度增高,军团菌病爆发和流行的可能性越来越大。因此,对该病进行有效的防治已引起社会的普遍关注。

军团菌病的早期准确诊断不但有利于该病的治疗,而且可有效降低其死亡率。目前,军团菌病的诊断方法主要有血清学诊断、尿抗原测定、以及通过PCR、qPCR等检测特定目的基因片段的分子生物学方法〔6-7〕。虽然从呼吸道分泌物中分离出相应的病原体仍被认为是诊断该病的金标准,但由于该方法灵敏性低,耗时长,且绝大部分军团菌肺炎患者不分泌痰液,故临床实验室实际应用价值不大〔7-8〕。又由于军团菌肺炎与其他原因引起的肺炎的临床表现难以区别,容易造成误诊。因此,对军团菌病进行快速、准确的早期诊断具有十分重要的临床意义。

据文献报道,嗜肺军团菌可侵入哺乳动物巨噬细胞,逃避吞噬体和溶酶体的杀伤作用,并在其中生长繁殖,这与嗜肺军团菌的致病机制密切相关〔9-10〕。Edelstein等采用信号标记转座子诱变(signaturetagged transposon mutagenesis)技术研究发现了1个编码约28kDa蛋白的军团菌毒力基因(Legionella virulence gene,lvgA),认为lvgA蛋白与军团菌在宿主细胞中的存活紧密相关〔11-12〕,但其分子致病机制不明。

本研究试图通过生物信息学方法对嗜肺军团菌lvgA基因进行分析,同时利用细胞模型检测军团菌毒力基因在军团菌感染宿主细胞后的表达变化,为阐明该基因的功能和致病机制提供理论基础,并建立基于军团菌lvgA基因检测军团菌的实时荧光定量RT-PCR,为该病的早期诊断提供有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料 嗜肺军团菌LP1标准株由浙江省疾病预防控制中心微生物所惠赠。大肠杆菌JM 109由本所保存;细菌RNA/DNA提取试剂盒,cDNA合成试剂盒,PCR系列试剂,T-A克隆试剂盒,质粒pMD18-T,限制性内切酶NdeI、XhoI,T4DNA连接酶均购自 TaKaRa公司。人单核巨噬样细胞THP-1购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。

1.2lvgA基因序列及其蛋白结构分析 将嗜肺军团菌Corby株、Lens株和Paris株的lvgA基因序列进行比对,并将蛋白序列输入http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi数据库预测其功能结构域,采用TMHMM Server v.2.0预测该蛋白在细胞膜上的定位情况。

1.3 基因组DNA的提取及lvgA基因的扩增 采用细菌DNA提取试剂盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)提取嗜肺军团菌基因组DNA。根据lvgA基因参考序列(Gen-Bank accession No.：NC_009494)的限制性内切酶位点分析结果〔8〕,采用Primer Designer软件自行设计PCR引物并由上海Invitrogen公司合成。引物序列：上游5'-GCG CAT ATG (Nde I)GCA GAC GGC GAT ATC-3',下游 5'-GCG CTC GAG(XhoI)TT T TCG TGC AGT AGT TGC-3'。采用PCR试剂盒扩增全长lvgA基因片段,反应总体积为100 μ L,其中各引物浓度为250 nmol/L,DNA模板 100 ng。PCR 参数：94℃5 min;94℃30 s、50℃30 s、72℃50 s,30个循环;72℃10 min。采用1.0%溴乙锭预染琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,预期扩增目的片段大小为624 bp。

1.4 目的基因克隆和测序 采用T-A克隆试剂盒将回收的目的扩增片段插入pMD18-T中,再转化至E.coliJM 109中并扩增,利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pMD18-T-lvgA。pMD18-T-lvgA经NdeI和XhoI双酶切初步鉴定后,委托上海invitrogen公司测定插入片段的核苷酸序列,然后与lvgA基因参考序列(GenBank accession No.：NC_009494)进行比对。

1.5 宿主细胞中军团菌总RNA的提取以及cDNA的合成 按100∶1的比例用军团菌感染THP-1细胞,在37℃条件下孵育1、2、4、8h后去除上清液,用PBS将细胞洗涤三次。采用细菌RNA提取试剂盒(MiniBEST RNA Extraction Kit)提取不同样本中的总RNA。将总RNA用DNase处理后用逆转录试剂盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)合成cDNA,并以此为荧光定量PCR的模板。正常条件下培养的嗜肺军团菌被用作对照。

1.6 实时荧光定量RT-PCR 根据本研究中所检测的嗜肺军团菌lvgA基因序列及GenBank中嗜肺军团菌16S rDNA基因序列(Accession No.：NC_006368),采用Primer Express软件,设计用于荧光定量PCR扩增lvgA基因片段以及作为内参的16S rDNA基因片段的引物。用于扩增lvgA基因片段以及16S rDNA基因片段的引物分别为：5'-TCATAGAACCCGAACTGATACCTGG-3',5'-GCACATAGACATGCCTGCACTAAAC-3',和5'-GAAGAACCT TACCTACCCT TGACATACAG-3',5'-TCGT TACGGGACT TAACCCAACATC-3'。扩增产物大小分别为 125bp、133bp。采用TaKaRa公司 SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒对不同逆转录产物样本进行检测。反应体积为 50 μ L,内含 1×SYBR Premix Ex-TaqTMII、10 μ mol/L 各引物、1 ×ROX Reference Dye II、逆转录产物4 μ L。利用ABI7500 Realtime PCR仪进行扩增 ,反应参数 ：95℃10 s、95℃5 s、60℃34 s,40个循环。之后采用△△CT数学模式对实时荧光定量PCR结果进行分析。同时采用SPSS统计学软件对嗜肺军团菌lvgA基因转录水平相对值进行t检验等统计学分析。

1.7 临床样本中lvgA基因的检测 检测样本来自金华市中心医院的30份肺炎患者血液,其中10份经病原学检测为嗜肺军团菌阳性。实时荧光定量RT-PCR检测的扩增体系：总反应体系为50μ L,包括 SYBR Premix EX Taq II(2×)25μ L、上游引物(10μ mol/L)2.0μ L 、下游引物(10μ mol/L)2.0μ L 、ROX Reference Dye II(50 ×)1μ L、模板 DNA 4μ L,用ddH2O补足至50μ L。反应条件：95℃预变性10s后,采用二步法进行反应：95℃5 s、60℃30s,40个循环。在60℃设定荧光检测点。每个循环结束后采集数据,反应结束后根据扩增曲线判定结果,ct值＜35,且反应曲线良好判为阳性〔13〕。

2 结 果

2.1 嗜肺军团菌lvgA基因的PCR扩增 采用如上所述的特异性引物对所提嗜肺军团菌LP1基因组DNA进行PCR扩增。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,扩增得到一条产物大小的lvgA基因片段条带。通过TA克隆,成功构建了pMD18-T-lvgA质粒,结果见图1。

2.2 嗜肺军团菌不同菌株lvgA基因核苷酸序列及其氨基酸序列分析 通过TA克隆、测序,将嗜肺军团菌LP1基因组DNA中的lvgA基因序列与已报道的其他菌株中的lvgA基因序列(GenBank No.：NC_006369、NC_009494、NC_006368)进行比较分析,与嗜肺军团菌LP1lvgA基因核苷酸和氨基酸的相似性分别为：99%,96%,96%和99%,98%,98%,见图2,3。

图1 嗜肺军团菌基因组DNA中扩增的lvgA基因目以及质粒pMD18-T-lvgA的酶切鉴定M：marker(TaKaRa);1：嗜肺军团菌 lvgA基因扩增条带;2：双酶切鉴定质粒 pMD18-T-lvgA。Fig.1 The amplification result of lvgA gene from DNA of L.pneumophila and identification of plasmid pMD18-T-lvgA by restriction enzyme digestionM：mark(TaKaRa);1：Amplification result of lvgA gene from L.pneumophila;2：Identification of plasmid pMD18-T-lvgA by double enzyme digestion.

2.3lvgA基因中保守功能结构域及跨膜结构预测结果 通过Blast比对发现,虽然嗜肺军团菌 LP1中的lvgA基因为毒力相关基因,但在其氨基酸序列中未发现存在某种保守功能结构域。通过跨膜结构预测发现LvgA蛋白为1种定位于外膜并部分表面表达的单体结构。

2.4lvgA基因转录水平的变化 本研究采用实时荧光定量RT-PCR检测嗜肺军团菌LP1在37℃条件下感染 T HP-1细胞2、4、6、8h后,其lvgA基因转录水平的变化情况。结果表明,嗜肺军团菌LP1感染THP-1细胞2h后,lvgA基因转录水平上调明显,比正常培养条件下嗜肺军团菌LP1的lvgA基因转录水平最大上调4.3倍。提示lvgA基因可能与嗜肺军团菌 LP1在巨噬细胞中的存活有关,见图4。

2.5 临床样本中lvgA基因的检测结果 经基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR检测显示,军团菌感染患者的血清检测结果均为阳性而其他肺炎患者的血清检测结果均为阴性,见图5。

3 讨 论

嗜肺军团菌有15个血清型,其中1型在人军团菌获得性肺炎中最为常见。嗜肺军团菌lvgA基因为军团菌所特有,对其在宿主体内保持完整的毒力必不可少。该基因可能对嗜肺军团菌在宿主细胞中的增殖、宿主的局部抗菌效应以及感染后激发全身性炎性反应等均密切相关。深入研究lvgA基因对阐明嗜肺军团菌的毒力及致病机制具有重要意义〔14-15〕。

图2 4株嗜肺军团菌lvgA基因核苷酸序列比较1-3：嗜肺军团菌 Lens株,Corby株,Paris株 lvgA基因核苷酸序列,4：嗜肺军团菌1型菌株 lvgA基因核苷酸序列。Fig.2 Comparison sequences of lvgA genes from four L.pneumophila strains1-3：lvgA gene sequences form L.pneumophila strain Lens,Corby,Paris.4：lvgA gene sequence form L.pneumophila type I.

本研究采用TA克隆技术构建了在宿主菌中高拷贝、性质稳定的pMD18-T-lvgA。通过基因测序、生物信息学分析,发现嗜肺军团菌1型中的lvgA基因与嗜肺军团菌Corby株、Lens株和Paris株中的lvgA基因序列极其相似,核苷酸和氨基酸序列的相似度分别为99%,96%,96%和99%,98%,98%,说明lvgA基因保守地存在于嗜肺军团菌中。从氨基酸序列的比对发现某些核苷酸的突变并未引起相对应氨基酸的改变,也进一步说明了lvgA基因表达产物序列、功能的保守性。通过膜定位分析预测并发现lvgA基因表达产物是1种定位于外膜的单体结构。上述结果强烈提示lvgA基因可以作为研制军团菌病疫苗的候选基因。

为了阐明嗜肺军团菌lvgA基因的潜在功能,分析嗜肺军团菌在不同条件下lvgA基因的表达变化是首要问题。据文献报道,嗜肺军团菌可侵入哺乳动物巨噬细胞,逃避吞噬体和溶酶体的杀伤作用,并在其中生长繁殖。本研究采用实时荧光定量RTPCR检测嗜肺军团菌在体外感染巨噬细胞后lvgA基因转录调控情况。结果显示该基因转录水平最大上调达4.3倍,表明嗜肺军团菌毒力基因lvgA表达产物确实与该菌在巨噬细胞中的存活和增殖有关。

目前实验室诊断嗜肺军团菌病的常用手段主要有细菌培养、直接荧光抗体染色、尿军团菌抗原测定和PCR试验等方法,但均存在不足之处。对军团菌病进行早期准确诊断需要有更敏感、稳定、准确的检测方法。本研究表明嗜肺军团菌在感染巨噬细胞的过程中转录水平上调明显,而且lvgA基因在各个菌株中保守存在,提示建立基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR,不但可有效地在军团菌感染早期进行检测,而且可提高检测的灵敏度。本研究中,以此法检测肺炎患者的血液样本,只有嗜肺军团菌肺炎患者血液样本为阳性。因此表明,如能进一步优化反应体系等手段,我们所建立的基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR技术,完全可以用于临床实验室进行敏感、特异、快速、准确地检测血液样本中的嗜肺军团菌。

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